高效液相色谱法ppt课件.ppt

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1、第七章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC1气相色谱中的“气相”代表什么意思？气相色谱：流动相是气体液相色谱：流动相是液体2第一节高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法（HPLC）特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：15-35MPa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）3二、HPLC与

2、GC差别1．分析对象不同GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测GC能检测的物质占有机物总数的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测HPLC能检测的样品占有机物总数的80%42．流动相不同GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲

3、合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起促进作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件不同HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）GC：加温操作5三、HPLC的特点和实际应用1、利用其高柱效（n=104塔板/米），有效分离复杂体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质反相色谱分离水溶液中的物质——生化物质。2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型待测物的含量。（蛋白

4、质、氨基酸、常见阴阳离子等）3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。6第二节高效液相色谱仪一、高效液相色谱法流程图贮液器高压泵进样器色谱柱检测器数据处理与显示系统梯度洗脱装置71.高压泵HPLC利用高压泵输送流动相通过整个色谱系统。由于色谱柱很细（直径1～6mm），固定相颗粒极细（直径5～10μm），因此柱阻力很大，必须有很高的柱前压力，才能达到快速高效的分离。高压泵应满足以下要求：较高的输出压力，30～50MPa。输出流量精确度高，并有较大调节范

5、围。分析型HPLC流量为0.1～10mL/min，制备型为50～100mL/min。输出压力要平稳。否则检测器噪声将增大。密封性好，便于更换溶剂，耐腐蚀。8高压泵分为恒流泵和恒压泵两类。恒压泵：流量受柱压影响，不稳定。恒流泵：流量不受柱压影响。常用的类型是柱塞往复泵。92.梯度洗脱装置梯度洗脱是指在一个分析周期中，按一定程序连续改变流动相中两种或多种溶剂的组成，使各组分都在适宜的条件下分离。时间min水%甲醇%流速mL/min0.0085151.52.0075251.58.0070301.59.0060401.5采

6、用梯度洗脱可以提高分离度，缩短分离时间。其缺点在于可能引起基线漂移。10梯度洗脱分为高压梯度洗脱和低压梯度洗脱两类：高压梯度洗脱：利用两台高压泵将溶剂增压后输入梯度混合室，加以混合后送入色谱柱低压梯度洗脱：在常压下先将溶剂按程序混合后，再用泵增压送入色谱柱。目前多采用低压梯度洗脱。113.进样装置好的进样装置应满足：样品被瞬时注入到色谱柱的柱头中心形成一个小“点”，重现性好，可在高压下操作。常用的进样装置有以下两种：（1）注射器进样进样方式同气相色谱。缺点是只能在低压或停流状态下进样，易漏液且重复性差。（2）六通阀

7、进样可直接向压力系统内进样而不必停止流动相的流动。进样体积准确，重现性好。12进样前进样中（Load）进样后（Inject）高压泵六通阀色谱柱134.色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱内径4.6mm或3.9mm，长度15～30cm，不锈钢柱，填料颗粒5～10μm，柱效为7000～10000理论塔板数/m。发展趋势：减小填料颗粒度（3～5μm），可减少柱长，加快分析速度；减小柱内径（＜1mm），降低溶剂用量，提高检测浓度。色谱柱填料145.检测器理想的检测器应具有灵敏度高、重现性好、响应快、线性范围宽、使用范围广、

8、对流动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特性。HPLC常用的检测器有：紫外检测器光电二极管阵列检测器荧光检测器示差折光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器155.1紫外检测器是HPLC广泛使用的检测器，其检测原理与紫外可见分光光度计相同。结构简单；测量池体积在5～10μL之间，但是光路长5～10mm；灵敏度高，最小检测浓度达10-9g/mL；对温度和流速不敏感