高效液相色谱法ppt课件.ppt

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1、第四章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography本章要求⒈了解高效液相色谱法的优缺点⒉了解高效液相色谱仪的结构⒊掌握常用检测器的原理及应用范围定义：以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）：20世纪60年代末70年代技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器特点：速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化一、概述4.1高效液相色谱法简介1．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较⑴高速：HPLC分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。⑵高效：HPLC高压(2~6MPa)下操作，填

2、料颗粒小(2~50m)，规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高(N=4000~60000块/m)，分离效率高。⑶高灵敏度：现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测限可达10-9g；荧光检测器最小检测限可达10-11~10-13g。⑷高自动化：HPLC进样量小(X~X0L)。带有自动进样装置和工作站。2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较⑴适用范围GC适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物，HPLC不受此种限制。气相色谱一般都在较高温度下进行，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。⑵流动相GC流动相仅运载样品，

3、不起分离作用，但无毒，易于处理。而HPLC流动相除了运载样品外，还有分离作用，可改变流动相组成，进行有效的分离。但流动相一般有毒，费用高。⑶色谱柱GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效很高(理论塔板数N=104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25cm，柱效(理论塔板数N=103~104)，低于GC柱。⑷检测器与GC相比，HPLC检测器种类较多。⑸制备色谱GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。HPLC可进行制备，即制备色谱。一﹑高效液相色谱仪的结构4.2高效液相色谱仪一般分为4个主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还

4、配有辅助装置：如梯度洗脱、自动进样及数据处理等。工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。数据分析系统输液系统进样系统分离系统检测系统HPLC的系统组成数据处理系统1.高压输液系统：一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。高压泵应满足如下要求：流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。能抗溶剂的腐蚀，耐酸、耐碱。有较高的输送压力。一

5、般分离，6.0×104Pa压力；高效分离，要求达到1.5~3.0×107Pa的压力或更高。④泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种:㈠恒流泵是在一定操作条件下，输出流量恒定，与色谱柱引起阻力变化无关。㈡恒压泵能保持输出压力恒定，其流量随色谱系统阻力而变化，保留时间的重现性差。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵，恒流泵又称机械泵，又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。梯度洗脱装置在液相色谱中，改变流动相可以改善分离效果。因此在分离复杂混合物时，按照一定的程序连续改变流动相的组成，可提高分离效率和加快分析速度。梯度洗脱装

6、置就是为此目的而设置的一种装置。梯度洗脱装置有两类：低压梯度：常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输出色谱柱；高压梯度：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。在分离过程中，使流动相的组成、极性、pH等按一定程序连续变化，使样品中各组分能在最佳条件下出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离。通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力，梯度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。梯度洗脱的优点：①改善峰形；②提高柱效；③减少分析时间；使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持

7、良好的柱性能（但进行下次分析时，更换流动相达到平衡时间长）。梯度洗脱与气相色谱的程序升温十分类似，两者的目的相同，不同的是程序升温是通过改变柱温，而液相色谱的梯度洗脱是通过改变流动相的组成、极性、pH来达到改变k的目的。在高效液相色谱中，常用的进样方式：高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品，即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控制，试样不充满取样环，只填充一部分体积