高效液相色谱法测定炎热清胶囊中栀子苷和黄芩苷的含量课件.ppt

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1、高效液相色谱法测定炎热清胶囊中栀子苷和黄芩苷的含量检测波长的选择通过紫外的全扫描可以看出栀子苷在240nm左右有最大的紫外吸收，该波长与国家药典中栀子药材“含量测定”项下规定的检测波长238nm[2]相接近,且样品中栀子苷的含量较少，在250nm以后的高波长紫外吸收很小；黄芩苷在278nm处有最大的吸收。考虑栀子苷的最大吸收波长240nm为含量测定波长，以提高栀子苷的灵敏度，且黄芩苷在此波长下也能准确的定量提取溶剂的选择根据黄芩苷或栀子苷的化学性质,实验中先以甲醇,70%乙醇和无水乙醇为溶媒,以黄芩苷或栀子苷的提取量为指标进行考察。结果均以甲醇的提取效率最优,故选用甲醇作为提取溶剂。提取

2、方法的选择常用的黄芩苷提取方法有回流法与超声波提取法[3,4].据有关研究称[5],超声提取法要优于回流法，故本实验采用超声提取法来对样品进行提取，并对提取时间进行了考察。实验中比较了20分钟，30分钟，40分钟，50分钟，60分钟超声提取法，分别进样比较发现30分钟，40分钟，50分钟提取出的栀子苷和黄芩苷的量大致相同，60分钟时增加不明显，所以选择30分作为提取时间，提高了工作效率流动相的选择据有关资料显示，同时检测黄芩苷和栀子苷的常用流动相有：1.甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)[8];2.甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(25∶75)[9];3.乙腈-0.2%磷酸[7];4.磷酸

3、盐缓冲液(pH2.8)-甲醇(60:40)[8].通过比较和实验发现当乙腈比例大时，保留时间短，分离效果差；而甲醇比例加大，虽分离效果较好，但保留时间过长。最终确定选用第三种方法中的流动相，并采用梯度洗脱程序。试验中根据进样后色谱图的具体情况不断调整流动相中乙腈和磷酸水溶液的配比,流动相的流速。经反复比较,得到了正文所述的流动相条件。在此条件下,黄芩苷和栀子苷的分离效果及峰形最好仪器色谱仪：Agilent1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)包括色谱柱AgilentEclipseXDB－C18(150mm×4.6mm,5μm）、二极管阵列检测器、溶剂传输泵，AB204-S分析

4、天平（上海精科天平），DFT-200克手提式高速中药粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）。超声仪：DL-720D数控超声波清洗器（上海文信仪器有限公司），微孔抽滤：AP-01PRACUUMPUMP(220V,50HZ)。色谱条件色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C18(4.6×150mm,5µm)；填充剂：十八烷基键合硅胶；流动相:(A)乙腈-(B)0.2%磷酸水溶液，具体梯度洗脱程序如下表1所示序号时间(min)A%(乙腈)B%(0.2%磷酸)流速(ml/min)100.00014860.429.00014860.4310.00025751.000检测波长为240nm，柱温为3

5、0℃，进样量为4µl/针，在该色谱条件下黄芩苷的出峰时间约为9.9min，栀子苷的出峰时间约为16.0min，二者的峰都与共存的其他成分分离良好样品溶液色谱图min024681012141618mAU050100150200250A12栀子苷黄芩苷阴性对照（不含栀子）溶液色谱图min024681012141618mAU020406080100120B2黄芩苷阴性对照（不含黄芩）溶液色谱图min02.557.51012.51517.5mAU0255075100125150175C1栀子苷阴性对照（不含栀子和黄芩）溶液min024681012141618mAU0102030405060708

6、0D对照品溶液色谱图min024681012141618mAU020406080100120140160E12栀子苷黄芩苷min024681012141618mAU020406080100120140160E12min024681012141618mAU01020304050607080Dmin02.557.51012.51517.5mAU0255075100125150175C1min024681012141618mAU020406080100120B2min024681012141618mAU050100150200250A12线性关系考察精密量取栀子苷、黄芩苷混合对照品溶液2、4、

7、6、8、10µl。按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，进样量X(µg)为横坐标，绘制标准曲线(见表2及图1)。结果表明栀子苷回归方程为:y=1718.1818x+125.5999(r=0.9999),在0.22～1.10μg范围内呈良好的线性关系;黄芩苷回归方程为:y=1063.8235x—35.2001(r=0.9999),在0.68～3.40μg范围内呈良好的线性关系。线性关系图栀子苷标准曲线图0500