高效液相色谱课件.ppt

《高效液相色谱课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第四章高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)一、概述20世纪60年代末70年代初理论：气相色谱的理论技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。1．高效液相色谱法与经典液相色谱法优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。2．高效液相色谱法与气相色谱法①分析对象。②流动相。③温度。二、高效液相色谱仪主要结构：高压输液系统，进样系统，分离系统检测系统。辅助装置：如梯度淋洗，自动进样数据处理等。1．高压输液系统部件

2、组成：储液罐，高压输液泵（核心），过滤器，压力脉动阻尼器⑴储液罐化学惰性低压脱气法吹氦脱气法超声波脱气法⑵高压输液泵、①要求：流量稳定，无脉动输出压力高流量范围宽耐酸，碱缓冲液腐蚀泵体易于清洗：具有梯度洗脱功能，②高压输液泵的分类液压隔膜泵气动放大泵注射泵往复柱塞泵A、液压隔膜泵B、气动放大泵C、注射泵D、往复柱塞泵往复泵的优点：液缸容积小，易于情况，更换系统，特别适合于梯度淋洗，广泛应用于HPLC，但：有脉动，D、往复柱塞泵克服脉动办法：①采用多头泵交替联动②压力脉动阻滞器③改进驱动凸轮的几何形状WATERS

3、泵的特点、泵体、脉动阻滞器、驱动凸轮。⑶梯度洗脱装量梯度洗脱，又称：溶剂程序分类：1：低压样度洗脱装置2：高压梯度洗脱装置2．进样系统高效液相色谱法中对进样技术要求较严。以克服柱外展宽（又称柱外效应）较突出。注射器、进样阀3分离系统——色谱柱色谱柱:柱管与固定相两部分。柱管材料:玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。故金属管用得较多。柱长5～30cm，内径为4～5mm（4.6mm,5mm），凝胶色谱柱内径3～12mm，预柱。粒度（＜20μm）填充法:匀浆填充法，4．检测系统有两种基本类型的检测器。

4、一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:（l）紫外检测器最常用：80%的化合物有紫外吸收应用最早，最广灵敏度高对环境温度及流速波动不敏感可适用于梯度洗脱原理：比尔定律A、紫外检测器的分类与特点单波长式多波长式紫外/可见分光式光电二极管阵列快速扫描式a单波长紫外检测器1如紫外—254检测器光源：低压录灯254nm80~8

5、5%检测池：样品池小于10ul光路长：10mm参比池：空气光电接收元件：光电倍增管光电管光敏电阻b多波长紫外检测器光路：与单波长紫外吸收检测器一致，但：光源是氘灯或氢灯波长：200~400nm，灵敏度：比254nm紫外检测器要低。c紫外—可见分光式检测器是装有流通池的紫外—可见分光光度计，光源：氘灯和钨灯d扫描型可变波长紫外检测器在色谱流停止工作的情况下，记录样品池中洗脱组分的吸收行为，既可提供色谱图，又可提供光谱图；既可定量，又可定性分析。但，中断色谱信息，不方便。e光电二极管陈列紫外检测器DAD1976年开

6、始报道可获得“在流”色谱的全部光谱信息，即不必停留。可能随色谱峰扫描。与其他快速扫描检测器相比：结构简单；工作可靠；性能好。光路特点工作原理核心：二极管阵列元件是一般由200~1024个组成光波范围：200~600mm每只分辨率为1~2nm光点管越多，分辩率越高如使用211个二极管陈列元件，最快时10ms可是成一次测量。因而每秒可收集20000多个数据可以得到三维图。应用色谱峰纯度检查。比较光谱法、吸收比法。色谱峰鉴定与标准品或标准光谱比较正常紫外光谱的比较导数紫外光谱的比较三维色谱能提供更多全面的信息。（2）

7、荧光检测法在HPLC种仅次于紫外检测器。灵敏度高。最小检测限比紫外低一个数量级。选择性好，优于紫外。但应用没有紫外广泛。可以衍生化反应工作原理光致发光现象（3）电化学检测法利用电化学固有的灵敏度线性范围106，高灵敏度10-12g，可与荧光相比，具很强的专属性。理论基础法拉第第一定律在电介过程中，电极上起反应的物质量（W）与通过电介池的电量（Q）成正比。法拉第第二定律各种不同的电介质溶液中，通过相同的电量时，电极上析出的电极产物的当量数相同。（96487库仑）电化学检测种类电流检测器安培检测器，应用最为广泛的一

8、种。组成：工作电极，参考电极，辅助电极电量检测器测电量：根据法拉第定律可计算组分的浓度。（4）化学发光检测法：某些物质，进行化学反应，生成处于激发态的中间体和反应产物。激发态→回→基态→化学发光化学发光的反应条件：反应的自由能应足以生成电子激发态的产物常用的化学发光剂：光泽精C、鲁米诺（5）示差折光率检测器通用性检测器。根据化合物的折光率不同。光会偏转。光偏转的程度与样品的浓度成正比。