高效液相色谱PPT课件

《高效液相色谱PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第九章高效液相色谱1906年，俄国生化学家茨维特第一个运用玻璃柱分离植物色素，并取得较好的分离效果，成为世界公认的液相色谱的奠基人。但受当时技术条件的限制，这种经典的柱色谱由于柱效、回收率、重现性等因素的影响，未能迅速发展直到20世纪60年代末70年代初，人们将GC色谱的原理引进液相色谱以后，才演变成今天的分离性能好、分离速度快、使用范围广的高效液相色谱（HPLChighperformanceliquidchromatography）高效液相色谱的简史第一节基本原理1、样品不必气化2、分离温度低3、选择性好4、样品回收容易5、分离效果好一、HPLC的特点据不完全统计，

2、目前全世界已知的天然和合成的化合物有超过500万种以上，其中70~80%化合物可用HPLC分析，而只有20%可用GC分析如:1.利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离小麦胚乳醇溶蛋白2.武汉化工学院测试中心:采用高效液相色谱法,在C18柱上,以甲醇—乙酸乙酯(95：5,体积分数)为流动相,检测器波长为275nm,测定了维生素A醋酸酯,维生素D3和维生素E醋酸酯的含量二、HPLC的分类1、高效液-固吸附色谱2、高效液-液分配色谱3、高效离子交换色谱4、高效离子对色谱5、高效排阻色谱三、HPLC的分离原理1、高效液-固吸附色谱根据吸附与解吸附机制。首先，样品组分吸附于

3、固定相，再用流动相（洗脱剂）进行洗脱时，使这种吸附作用解离，样品组分随流动相洗脱出柱2、高效液-液分配色谱根据各组分在两液相（固定相和流动相）中的分配系数的不同进行分离分配系数K=在色谱系统中存在互不相溶的两相，一为固定相，一为流动相。当组分在固定相和流动相中分配达到平衡时，若某一组分在流动相中的浓度大于固定相中的浓度，则此组分必然先被洗脱出柱，即在色谱图中先出峰；相反，若某一组分在固定相中的浓度大于流动相中的浓度，则此组分洗脱所需要的时间较长，在色谱柱中保留的时间较长，在色谱图中后出峰3、高效离子交换色谱离子交换剂包括可交换离子和离子基，如某一组分的被交换离子与离子

4、基的相互作用强，则可被交换，洗脱需时间就长；反之，不能被交换的物质则随着洗脱液与可交换组分分离开4、高效离子对色谱在流动相或固定相中加入与组分分子电荷相反的离子（配对离子），使之与组分离子结合，生成在水中不解离的化合物，迅速转移到有机相中5、高效排阻色谱凝胶色谱原理；分子筛效应1、输液系统2、进样系统3、分离系统4、检测系统5、数据处理系统四、HPLC仪的结构组成1、输液系统流动相贮存器高压泵梯度仪高压流动相通过色谱柱，可降低由于样品在柱中的扩散效应、边缘效应而导致伸舌峰、拖尾峰的出现(提高了柱效和分辨率)可使流动相随固定相和样品性质的改变而改变，如洗脱液的极性，离子

5、强度、pH值等，便于各种组分均能获得有效分离2、进样系统进样装置定量环注射器进样进样阀进样特点：简单、方便、价格便宜、进样量容易改变；但不适合高压（＞10MPa）进样，否则注射器爆裂适于高压操作，进样量比较精确，重复性好3、分离系统色谱柱连接器柱温箱分离系统的核心装置上接输液泵，进样阀，下接检测器（不得泄露）保证整个分离过程在一个适于组分分离的恒定条件下进行，因为温度变化会使tR发生改变（空气浴±1℃循环水浴：±0.1℃以内）4、检测系统检测器----检测由色谱柱洗脱下来的组分，根据其洗脱的先后顺序在色谱图中出峰，以tR表示洗脱的难易程度，以色谱峰的峰面积A表示组分含

6、量（有时用峰高H）5、数据处理系统此系统负责对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理如外标法中，测得对照品和供试品的峰面积，根据对照品溶液的浓度即可计算出样品浓度五、色谱柱根据制备方法不同分为填充柱和毛细管柱；其中最常用的是刚质填充柱，其填料即为带有固定相的担体。以微粒硅胶为基质的化学键合相是目前液相色谱法中应用最广泛的固定相。如RP-HPLC中运用最广泛的十八烷基键合硅胶（ODS）即是将一层细的丙烯桥双配位C18硅烷键合到硅胶上，可有效抑制硅胶在高PH条件下溶解，拓宽硅胶的稳定范围（PH2~11.5）。另外，ODS键合烷基C18链较长，对碳载量和溶质的保留值都增高

7、常用色谱柱的内径为4.6mm柱长15~25cm（4.6×25）六、流动相在RP-HPLC中，流动相为水和有机溶剂组成的混合溶液流动相的要求（1）各种有机溶剂尽可能用“色谱纯”或“HPLC用”的溶剂；水最好用超纯水或重蒸馏水；如果流动相含盐，应将配好的流动相经0.4μm或0.22μm的滤膜过滤后再用（2）使用前应进行脱气处理，否则分离效果不好，并且易损伤色谱柱（3）流动相应避免过酸或过碱，一般PH使用范围2.5~7.5；因为以硅胶为基质的键合固定相对酸和碱较敏感（4）性质稳定,不与固定相发生不可逆的化学反应（5）与检测器相匹配，对检测不产生干扰（6）对