《高效液相色谱HL》PPT课件

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1、高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）中南大学湘雅医学院医学检验系徐克前一　基本原理（一）定义HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同，进行连续的、无数次的交换和分配而达到分离的过程。组成：固定相—柱内填料流动相—洗脱剂（二）固定相（stationaryphase)和流动相（mobilephase）(1)化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶表面OHOH

2、

3、硅胶（SiO2•nH2O）––Si–O–Si––

4、

5、键合相反应R1

6、

7、

8、

9、–Si–OH+X–Si–R￫–Si–O–Si–R+HX

10、

11、

12、

13、R2硅胶有机硅烷键

14、合相X:Cl、CH3O、C2H5O等R:烷C8(C8H17)、C10(C10H21)、C18(C18H37)等R1R2:Z、CH3等(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料（octadecylsilyl,ODS）—万能柱即C18柱或ODS柱主要用于反相HPLC中，适用于各种类型的生物分子(3)短链烷基键合物短链烷基（c3、c4等）＋大孔硅胶键合物适用于氨基酸、小肽等生物小分子(4)键合到基质上的官能团性质反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，如C18、C8、C4等正相柱：填料是极性的，官能团为－CN、－NH2等离子交换键合相：阳离子官能团：－SO3H、－COOH等阴离子官能团－NH2、－R

15、4N+等2、流动相（mobilephase）流动相选择原则：1.样品易污，且溶解度尽可能大2.化学性质稳定，不损坏柱3.不妨碍检测器检测分析4.粘度低，流动性好5.易于从中回收样品6.无毒或低毒，易于操作7.易于制成高纯度，即色谱纯8.废液易处理，不污染环境反相色谱常用流动相及冲洗强度H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃最常用组成：甲醇/H2O、乙腈/H2O洗脱顺序：极性物先洗脱下来正相色谱常用流动相及冲洗强度正乙烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇二、分离模式正相HPLC反相HPLC离子交换HPLC凝胶HPLC亲和HPLC（一）正相HPLC（normalphase

16、HPLC,NP-HPLC）固定相：极性吸附剂（或极性键合　　　　　　　　　　相），如硅胶、Al3O2流动相：非极性或弱极性溶剂，如己烷、庚烷等洗脱顺序：非极性、弱极性、极性应用：石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等（二）反相HPLC（reversephaseHPLC,RP-HPLC）固定相：非极性物质，如C18(ODS)、C10、C8、C6、C4、C2流动相：极性溶剂，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等洗脱顺序：极性、弱极性、非极性应用：蛋白质、多肽等（三）离子交换HPLC（ion-exchangeHPLC,IE-HPLC）原理：用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定pH

17、下，组分电荷性质和数量不同而分离的技术分类：阳离子交换树脂：含酸性基团：阴离子交换树脂：磺酸基、磷酸基等合碱性基团：季胺基、叔胺基等应用：核酸、蛋白质、氨基酸等（四）凝胶HPLC（gelHPLC,G-HPLC）原理：基于分子大小和形状的差异进行分析的技术固定相：交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶流动相：水、乙醇、丙酮等应用：核酸、蛋白质、酶、多糖等（五）亲和HPLC（affinityHPLC,AF-HPLC）原理：利用生物大分子间专一的亲和力　进行分离的技术固定相：基质（琼脂糖凝胶等）交联配基（亲和性）应用：酶、抗体、抗原、受体等三、HPLC仪器HPLC仪一般由输液系统、进样系统、色谱柱、

18、检测器、记录和数据处理系统及计算机等几部分组成（一）输液系统：贮液及脱气装置梯度洗脱装置高压输液泵梯度洗脱装置高压输液泵（二）进样系统：（三）柱系统：（四）检测器：与泵、柱组成HPLC的三大关键部件1.紫外吸收检测器2.荧光检测器4.示差折光检测器表.HLPC常用检测器检测器原理检测下限（g/ml）检测范围紫外检测器具有紫外吸收性质10-7荧光检测器具有荧光物质10-14电化学检测器具有电解活性物质10-12示差折光检测器与流动相折光率不同10-7糖类等蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、激素等多环芳烃、氨基酸、维生素等食品、环境、生化、医学等（五）不同HPLC产品介绍：高效液相色谱仪器（

19、１）高效液相色谱仪器（2）高效液相色谱仪器（3）高效液相色谱仪器（4）四、定性和定量定性分析１．保留值定性：比较未知峰与标准物的保留　　　　　值２．收集未知峰洗脱液定性：物理分析，化学分析，生物学　分析３．联机定性：液质联用（ＨＣＬＣ－ＭＳ）液红联用（ＨＣＬＣ－ＩＲ）定量分析分析检测物质的量（或浓度）与检测器的响应值（峰面积或峰高）呈正比1.标准曲线法：也称外标法或直接比较法。用标准品等体积直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高）与其对照2.内标法：选择适