《高效液相色谱HPL》PPT课件

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1、高效液相色谱HPLC生物分析小组作业组长：姬付博小组成员：李云峰、向治霖、华俊豪、赵琳琳、张阳、刘鸣军、魏友武、董鹏、杨睿、罗静、查效兵、周桃、李建月目录基础知识应用及举例色谱是什么？色谱和层析的原理是一样的，只不过我们很多人通常认为色谱是在柱状填料中进行的，而层析则是在薄层介质上进行的。因此层析有时候称为薄层色谱，而色谱则被称为柱层析。结论：事实上色谱和层析是同样的概念，英文单词都是Chromatography我们都有用纸层析法分离叶绿素的经历。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之

2、得名。色谱法的发现薄层色谱常见的薄层色谱，也就是纸层析色谱法的分离原理溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检

3、测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相高效液相色谱HPLC——特点高压：压力可达150~300kg/cm2，色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。高速：流速为0.1~10.0mL/min。高效：理论板数可达10000以上，在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度：紫外检测器灵敏度为0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后

4、不被破坏，可以收集单一组分或制备。理论板数是指在一些分离操作中为完成某一指定分离要求所需理论塔板的数量。按分离机制分类液-固色谱法LIQUID-SOLIDADSORPTIONCHROMATOGRAPHY固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。液-液分配色谱LIQUID-LIQUIDPARTITIONCHRO

5、MATOGRAPHY液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法———采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法———一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据

6、统计，它占整个HPLC应用的80%左右。离子交换色谱ION-EXCHANGECHROMATOGRAPHY固定相：离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，有机酸、氨

7、基酸、多肽及核酸。离子对色谱IONPAIRCHROMATOGRAPHY又称偶离子色谱法，是液-液色谱法的分支。原理：它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。反相离子对色谱：非极性