分析化学高效液相色谱HPL

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1、第8章高效液相色谱法HPLCHighPerformanceLiquidChromatography特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。§8.1高效液相色谱仪四大部分组成：溶剂输送系统（贮液器，高压泵）进样系统（进样阀等）分离系统（色谱柱等）检测记录系统（检测器，记录仪等）1.高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一应具有压力平稳、脉

2、冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2.进样装置流路中为高压力工作状态通常使用耐高压的六通阀进样装置3.分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10mm高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温匀浆法填充柱：将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米4.检测器要求:灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,对温度和流速的变化不敏感两种类型溶质型检测器：仅对被分离组分的物理或理化性质响

3、应如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器总体型检测器:对试样和洗脱剂均有响应如示差折光，介电常数检测器UV检测器最常用，占70％池体积:1～10μL光程常:2～10mm波长:254nm窗口:石英折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）因n～f（T），故需精密恒温（±0.001℃）灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱用于无紫外吸收的化合物，如糖类伏安计、安培计、库仑计和电导计等,首选安培计可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质电极表面易中毒5.梯度洗脱分配比k相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开

4、可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH，以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的梯度洗脱装置分为两类：外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在LC中所

5、起的作用相当于GC中的程序升温：通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值，在GC中借程序调节温度改变k值。§8.2几种常见的液相色谱形式1.液液色谱（分配色谱）1941年Martin发明:用吸着在硅胶上的水作为固定相，用氯仿为流动相应用范围：最常用方法。相对分子量小于3000，不带电的极性化合物分离原理固定液通过分子间的亲和力或化学键合力附着在粒度很细的惰性载体表面上，被分离的组分溶解在流动相中，并按其分配系数K在两相之间进行分配K不同导致迁移速度不同，从而使不同组分得到分离固定液的流失样品一定要在两

6、相中均能溶解才能分,分离，因而两相在某种程度上互溶长时间使用将导致固定液流失，不利分离防止固定液流失的方法???防止固定液流失的方法方法一:抑制柱在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失缺点：麻烦不能采用梯度洗脱技术方法二:化学键合固定相将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面反相色谱固定液为非极性洗脱液为极性，如水（常用方法,75%)C18柱（十八烷基化的SiO2填充柱）为标准色谱柱应用：醇类、芳香族

7、、蒽醌素、抗菌素、低聚物、甾族化合物,维生素等极性不太大的组分正相与反相液液分配色谱正相色谱:固定液为极性，洗脱液为非极性常用于分离极性化合物，极性大的组分保留时间长，后出峰固定液：水、甘油、ß，ß’—氧化二丙腈（极性）流动相：己烷、苯、氯仿（非极性）2.液固色谱(吸附色谱)分离原理固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同来进行分离的固体相:极性的硅胶，Al2O3,MgSiO3等硅胶柱的柱效高，容量大，最常见流动相“相似相用”:如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强

8、度参数e表征，e越大，极性越强应用分离极性不同的化学物,同分异构体不适用同系物的分离3.离子交换色谱1975年H.Small发明,现为发展最快的分支分离原理:离子交换树脂为固定相,试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生离子交换反应平衡常数K=﹝-NR4+X-﹞﹝Cl-﹞/﹝-NR4+Cl-﹞﹝X-﹞K越大,溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大磺酸型阳离子交换树