DB50∕T 953-2019 饲料中大肠杆菌O157的快速检测方法环介导等温扩增（LAMP）法.pdf

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1、ICS65.120B46DB50重庆市地方标准DB50/T953—2019饲料中大肠杆菌O157的快速检测环介导等温扩增（LAMP）法RapiddeterminationofEscherichiacoliO157infeeds——Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethod2019-12-12发布2020-03-15实施重庆市市场监督管理局发布DB50/T953-2019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由重庆市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心，重庆市兽药

2、饲料检测所。本标准主要起草人员：胡健、周莉、侯亚莉、朱英才、盛欣、丁平、何义刚、张毅、王美珍、张军等。IDB50/T953-2019饲料中大肠杆菌O157的快速检测方法环介导等温扩增（LAMP）法1范围本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）法检测饲料中大肠杆菌O157的原理、试剂、仪器和设备、操作步骤、结果判定和表述。本标准适用于饲料中大肠杆菌O157的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.36食品安全国家标准食品

3、微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施培养物和废弃物处理应按照GB19489的规定执行。4原理用热裂解法提取大肠杆菌O157的基因组DNA作为环介导等温扩增模板，根据大肠杆菌O157的rfbE基因特异序列，设计5条LAMP引物(参见附录A），建立LAMP反应体系，恒温反应结束后根据添加的染料显色情况进行结果判断。5试剂5.1除另有规定外，试剂为分析纯试剂，试验用水符合GB/T6682的要求。5.2改良EC肉汤（mEC+n）。5.3营养肉汤。5.4生理盐水。5.5双蒸水（d

4、dH2O）。5.6合成大肠杆菌O157检测用引物，包括外引物一对，内引物一对，环状下游引物一条。外引物F3：5’-TCTCAATTCTAACTAGGACCGCAGA-3’；外引物B3：5’-ATAACTTGCTCATTCGATAGGCTGG-3’；内引物FIP：5’-ACAGGGTAAAAAACTGGCCTGAGGAATTAAGGAATCACCTTGC-3’；内引物BIP：5’-CACGATGCCAATGTACTCGGAAAAATAATTCCACGCCAACCAAGA-3’；环状下游引物LB：5’-ATCAAAAGCACCCTATAGCTGAG-3。将各引物用双蒸水溶解，配

5、置成100mmol/L的储备浓度，用双蒸水稀释为10mmol/L工作浓度备用。5.7BstDNA聚合酶。5.8脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPS），包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L。5.9MgCl2溶液（50mmol/L）。5.1010×BstDNA聚合酶缓冲液（200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/LKCl、100mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/LMgSO4、1%TritonX-100）。5.11甜菜碱，用双蒸水溶解，配置成5mol/L溶液。1DB50/T953-20195.12钙黄绿素C46H46N2O2

6、3，用双蒸水溶解，配置成625μmol/L溶液。5.13MnCl2，用双蒸水溶解，配置成7.5mmol/L溶液。5.14阳性对照：大肠杆菌O157标准菌株基因组DNA。6仪器和设备6.1移液器，量程为0.5μL~10μL，10μL~100μL，量程100μL~1000μL。6.2无菌均质袋，500mL。6.3锥形瓶，500mL。6.4水浴锅或恒温金属浴，精度±1℃。6.5高速离心机，≥7000g。6.6恒温培养箱，精度±1℃。6.7电子天平：感量0.01g、感量0.0001g。7采样7.1采样原则样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能

7、的外来污染。7.2采样方法7.2.1应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于500g（mL）。7.2.2独立包装不大于500g的固态产品或不大于500mL的液态产品，取完整包装。7.2.3独立包装大于500mL的液态产品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均匀后采集适量样品，放入无菌采样容器内作为一个样品。7.2.4独立包装大于500g的固态产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部分分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件样品。7.3采集样品的贮存和运输7.