犬细粒棘球绦虫环介导等温扩增（lamp)诊断方法的建立

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2、疆·石河子2015年6月TheestablishmentofLoop-mediatedisothermalamplificationforEchinococcusgranulosusofDogsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByYeQian(Veterinarytechnicalservices)DissertationSupervisor：MaXun,BoXin-wenJune，2015石河子

3、大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名:时间：年（月1曰使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的

4、学位论文在解密后适用本规定。研究生签名:时间：(年（月1曰导师签名:h时间月9曰摘要棘球蚴病俗称包虫病，是由棘球属绦虫的幼虫——棘球蚴寄生于人和动物体内，危害严重的一种人畜共患寄生虫病。在我国导致棘球蚴病的绦虫主要是细粒棘球绦虫（Eg）和多房棘球绦虫（Em）。尽管经过几十年来的防治，但该病在新疆牧区仍然十分严重，巴州、阿勒泰、伊犁和喀什4个地区的羊包虫病感染率超过60%，犬带虫率在45%以上。由于城市化进程中伴侣动物的饲养给包虫病的发生提供了新的条件，城市中包虫病发生呈现增长态势。采用传统方法检测虫卵繁琐费时，且无法从犬粪便中区分细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的虫卵，因此建立一种快速、

5、简便、灵敏的能用于细粒棘球绦虫的流行病学调查及现场诊断方法具有非常重要的意义。根据环介导等温扩增技术原理和棘球绦虫线粒体基因文库数据，首先，针对细粒棘球绦虫线粒体基因组cox1，cox2，cox3，nad1，nad2，nad4，nad5，nad6等8个基因，通过PrimerExplorerV4分别设计2条外引物F3和B3，2条内引物FIP和BIP。利用8个基因的的外引物进行普通PCR筛选出细粒棘球绦虫特异的基因。根据筛选基因的4个引物通过60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃6个温度和10min、20min、30min、40min、50min、60min6个反应时间的优化，建

6、立最佳LAMP反应条件，然后检测LAMP方法的特异性和敏感性。结果显示，只有cox1，cox2，nad4，nad6基因在细粒棘球蚴囊液中出现特异性片段，在多房棘球绦虫、扩展莫尼茨绦虫、曲子宫绦虫、无卵黄腺绦虫、鞭毛线虫、捻转血矛线虫中未扩增出特异性片段，选择cox2作为LAMP扩增基因，最佳反应条件为63℃，40min。建立的LAMP只在细粒棘球蚴囊液检测管混浊沉淀，显色后为绿色；多房棘球绦虫、扩展莫尼茨绦虫、曲子宫绦虫、无卵黄腺绦虫、鞭毛线虫、捻转血矛线虫检测管澄清，显色后为棕色；LAMP的琼脂糖凝胶电泳也只有细粒棘球蚴囊液出现LADDER电泳带型，而在其他对照虫体中没有。以Egc

7、ox2标准重组质粒为模板，LAMP的敏感度为0.016fg/μL，比常规PCR（16.09fg/μL）敏感性高。为了检验LAMP方法的诊断效果，对50份犬粪便提取DNA后进行cox2LAMP、常规PCR和粪便抗原ELISA的检测，通过对比检测后发现LAMP与常规PCR和ELISA检测无差异，均只有4份样为阳性，符合率100%。I本研究初步建立针对细粒棘球绦虫线粒体cox2基因的LAMP诊断技术，试验结果表明该诊断方法具有良好的特异性和灵敏度性。LAMP不需