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1、环介导等温扩增（LAMP）技术检测牛肉中大肠杆菌O_(157)的研究【关键词】环介导等温扩增;LAMP;大肠杆菌O157;检测;【英文关键词】loop-mediatedisothermalamplification;EscherichiacoliO157;detection;【中文摘要】1885年,德国科学家T.Escherich首次发现大肠杆菌O157:H7,它是引起腹泻的重要致病菌。大多数食物中毒都可追溯到牛肉和未消毒的牛奶,而且感剂量小于100个细菌即可引起感染。目前对大肠杆菌O157:H7的检测方法主要有传统的常规培养法、免疫学检测方法和以PCR为代表的分子生物学检测方法。
2、传统方法操作繁琐,检测时间长,而且灵敏度较低;免疫学检测方法特异性和灵敏度不理想;PCR方法敏感、快速,但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程,难以在基层普及和推广。采用环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术,检测食品中的大肠杆菌O157:H7,具有灵敏度高,特异性强,检测方法简便,耗时短,检测成本低等特点,适宜在基层普及和推广。本研究针对大肠杆菌O157:H7(IQCC10102)rfbE保守序列(GenbankS83460),运用在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/index
3、.html)设计LAMP引物。对BST酶添加量、dNTP浓度、镁离子浓度等扩增条件进行了优化,确定25μL的LAMP反...【英文摘要】EscherichiacoliO157:H7wasfirstlyreportedbyT.Escherichin1885andlistedasamajorfood-bornepathogenwhichcancausediarrhea.Mostfood-borneintoxicationaffairsdrivedfrombeefandplainmilk,andlessthan100individualbacteriacanresultinintoxic
4、ation.Atpresenttime,themainmethodsforisolationandidentificationofE.coliO157:H7includeroutinecultivationmethod,immunologictestandPCR.TraditionalmethodforroutinedetectionofE.coliO157:H7iscomplex,time-consuminga...摘要4-5Abstract5-61引言10-291.1立题背景及意义101.2大肠杆菌0157:H7简介10-131.2.1大肠杆菌0157:H7生物学性状10-11
5、1.2.2大肠杆菌0157:H7的耐酸性和其主要毒力因子11-121.2.3大肠杆菌0157:H7的流行病学12-131.2.4大肠杆菌0157:H7的预防131.3大肠杆菌0157:H7的检测方法13-171.3.1常规培养法141.3.2免疫学检测方法14-151.3.3分子生物学检测方法15-171.4环介导等温扩增（LOOP-MEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATION，LAMP）方法17-281.4.1LAMP方法的概述17-181.4.2LAMP方法的特点181.4.3LAMP方法的引物设计18-201.4.4LAMP方法的基本原理20-241.4.5
6、LAMP的反应体系24-251.4.6LAMP反应产物的检测方法25-261.4.7LAMP方法的应用26-281.5研究内容28-292材料与方法29-383/32.1试验材料29-312.1.1试验菌株292.1.2仪器与设备29-302.1.3主要培养基30-312.1.4样品与生化试剂312.2试验方法31-322.2.1大肠杆菌0157:H7的培养312.2.2大肠杆菌0157:H7基因组DNA的提取31-322.3引物设计、体系和操作程序32-332.3.1LAMP引物设计32-332.3.2LAMP和PCR反应体系332.3.3LAMP和PCR操作程序332.4LAM
7、P反应条件优化33-342.4.1引物对LAMP反应的影响33-342.4.2最适M92+浓度选择342.4.3dNTP浓度的优化342.4.4反应温度的优化342.4.5BST酶的优化342.5.6反应时间的优化342.5引物特异性试验34-352.5.1LAMP引物特异性试验34-352.5.2PCR引物特异性试验352.6LAMP扩增产物的分析352.6.1LAMP产物的可视结果分析352.6.2LAMP产物的电泳分析352.6.3LAMP产物酶切结果分析352
