临床生物化学常用技术.ppt

《临床生物化学常用技术.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、临床生物化学检验常用技术第3章1本章主要内容光谱检验技术电化学分析技术电泳技术干化学技术PCR技术2教学目标和要求掌握光谱分析中的对比法、摩尔吸收系数法、比浊法测定的方法原理，在生化检验中的应用及注意事项；区带电泳的原理、应用及影响因素；离子选择性电极法测定的原理和注意事项。熟悉离心技术，其它电泳技术和层析技术中的HPLC及亲和层析的原理和应用；免疫分析技术、生物传感技术的概念和应用原理。了解色谱、层析等常用生化技术的应用原理和方法，生物芯片技术的概念和应用原理。3第一节光谱分析技术分光光度技术的基本原理分光光度计的基本结构分光光度计的操作方法分光光度技术的定性和定量方法

2、4光的本性光的描述：波长和能量可见光：400nm~760nm紫外光:200nm~400nm红外光:760nm~1000nm5光谱分析技术原理：利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法散射光谱分析技术：比浊法6一、分光光度技术的基本原理（一）吸光度与透光度A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透

3、过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：T=I/I0T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：7（二）Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：A=KLC式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）8吸收曲线（Ａ－Ｃ曲线）０　　１　　　２　　　　３　　　４　ＣＡ　1.00.80.60.40.2Y=

4、ax+b9吸光系数的应用１、定性２、判断方法的灵敏度３、定量测定物质浓度10偏离朗伯比耳定律的因素?1、光学因素2、化学因素3、为什么有的分光光度计使用双波长或双光束？11分光光度法的结构光源及光源要求波长的选择原则:可按“吸收最大，干扰最小”的原则进行。2、单色器3、比色杯及要求4、检测器与显示器12分光光度计的使用1、开启电源，将比色池盖打开，通电20分钟预热2、调节波长3、将空白液、标准液及样品液置于光路4、空白调节T为0、100%5、调A为06、重复4和57、测量标准和样品吸光度。13（二）吸光度的校正铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25℃，将4mg

5、铬酸钾溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。14四、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法定性依据：最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε2.摩尔消光系数ε方法1.最大吸收波长λmax方法15（二）分光光度技术的定量方法1、对比法1、将已知浓度的标准品和待测溶液有同一方法、在相同条件下同时进行测定。2、当标准液与标本用量可能不同时的测定。标准液的要求：其浓度尽量接近于样品浓度。（双标准）16（二）分光光度技术的定量方法2.标准曲线法用途：1、确定分析范

6、围2、减少系统误差3、比较方法的灵敏度17根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。方法：18作图法的步骤1、制备标准液2、显色反应3、比色4、作图5、制作检量表。19将一系列浓度不同的标准溶液按照、一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准

7、曲线找出相对应的待测样品的浓度，即标准曲线法。标准曲线法20制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1）浓度范围足够大（2）减少偶然误差（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。（5）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。（6）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。21第二节电化学分析技术电化学法概述电化学分析：利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法。主要有：电位法、电导法、电容法。22电位分析法基本原理电