激活态雪旺细胞对神经干细胞分化作用探究

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1、激活态雪旺细胞对神经干细胞分化作用探究　　哈尔滨医科大学附属第四医院骨科，黑龙江哈尔滨150086[摘要]目的探讨激活态雪旺细胞（SCs）对神经干细胞（NSCs）的分化作用。方法取出生24h内的SD乳鼠脊髓NSCs，分离培养并传至4代。取体重（100±5）g的SD大鼠，结扎右侧坐骨神经，1周后取双侧坐骨神经，左侧提取正常坐骨神经分离培养SCs（普通SCs），右侧提取结扎变性的坐骨神经分离培养SCs（激活态SCs），均采用双酶消化加差速贴壁法。将SCs与NSCs应用Transwell培养皿联合培养，分为三组：A组为激活态SCs与

2、NSCs；B组为普通SCs与NSCs；C组仅为NSCs。于培养的第2、4、6天检测各组NSCs活性。1周后，Westernblot检测各组SCs表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达水平，免疫荧光检测各组NSCs分化比例。结果传至4代的NSCs生长稳定，分离的SCs7d后大量增殖呈旋涡状。联合培养后MTT法检测细胞活性，第2、4天三组细胞的活性差异无统计学意义（P>0.05），第6天C组活细胞比例开始降低，A、B组与C组比较差异有统计学意义（P0.05）。Western10blot检测A组细胞表皮生长

3、因子（EGF）表达水平（0.486±0.028）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达水平（0.385±0.023）均高于B组，差异有统计学意义（P0.05）accordingtotheMTTdetection.However，thecytoactivebegantoreduceatthesixthdaybyMTTdetection，andthecytoactiveofgroupAandgroupBweresuperiorthanthoseofgroupC，thedifferenceswerestatisticallysig

4、nificant（P0.05）.TheexpressionofEGFandbFGFingroupA[（0.486±0.028），（0.385±0.023）]werebothhigherthanthoseingroupB，thedifferenceswerestatisticallysignificant（P　　[Keywords]Schwanncell；Neuralstemcell；Celldifferentiation；Co-culture；Neuron[基金项目]黑龙江省自然科学基金项目（编号D200901）；黑龙江省教育

5、厅科技研究项目（编号11531160）。[作者简介]张睿（1987.2-），男，哈尔滨医科大学2011级在读硕士研究生；研究方向：神经干细胞应用。[通讯作者]赵承斌（1958.5-），男，主任医师，教授，硕士研究生导师；研究方向：脊柱外科。10周围神经损伤是骨科常见的疾病之一，虽然周围神经具有一定的再生能力，但对于较大缺损却很难自身修复[1]。随着组织工程学领域研究的深入，神经干细胞（NSCs）已被公认为是对神经损伤修复的有效方法，通过NSCs在神经断端的不断分化，使受损的周围神经重新恢复连接。然而单纯形态学得连接不能保证神经

6、的传导功能，有研究表明，这与NSCs分化过程中分化为胶质细胞和神经元的比例有关[2]，提高神经元的分化比例，降低胶质细胞的表达可有效提高神经的传导速度，因此许多学者通过不同方法促进神经干细胞向神经元的分化[3-5]，均取得了一定进展。本研究通过激活态雪旺细胞（SCs）刺激NSCs的分化，观察其诱导NSCs分化为神经元的能力。1材料与方法1.1实验材料雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032]；DMEM/F12细胞培养基（Hyclone公司，美国）；青-链双抗，胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶（

7、碧云天，中国）；兔抗鼠单克隆抗体Nestin，FITC标记的羊抗兔IgG，兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮细胞生长因子（EGF）单克隆抗体，兔抗鼠MAP-2、GFAP单克隆抗体（武汉博士德公司）；Transwell培养皿（Corning公司，美国）。1.2实验方法1.2.1神经干细胞的分离培养与鉴定取出生24h内的SD大鼠，断髓处死后无菌条件下取出脊髓，显微镜下剥离硬脊膜，剪成5mm3组织块，加入0.25%胰酶消化1010min，用吸管反复吹打至单细胞悬液，加入5mLDMEM/F12培养基终止消化。1000r/m

8、in离心5min，弃上清，加入含20ng/mL的EGF和20ng/mL的DMEM/F12培养液，重悬后移入细胞培养瓶，置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。每6～8天传代1次，连续传4代。取第4代神经球，移入含有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板内，24h后取出盖玻片，4%多