tag—1和神经干细胞分化相关性探究

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1、TAG—1和神经干细胞分化相关性探究　　[摘要]目的研究微环境蛋白TAG-1与神经干细胞分化之间的关系。方法使用免疫荧光染色检测神经干细胞中巢蛋白nestin的表达，并过表达TAG-1后使用实时荧光定量PCR技术分析神经干细胞中分化相关蛋白的表达变化。结果体外培养的神经干细胞中过表达TAG-1以后，干性相关基因nestin和转录因子SOX2（SRY-box2）表达降低，神经元标志物神经元微管蛋白βⅢ（neuronalclassⅢβ-Tubulin，Tuj1）和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达升高。结论TAG-1可能与神经干细胞的分化存在正相关的关系，其分子调节机制有待

2、进一步研究。[关键词]TAG-1；神经干细胞；分化[中图分类号]R394[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2013）03（c）-0012-03近年来，神经干细胞（neuralstem8cells，NSCs）替代疗法已被用于研究神经系统功能缺陷性疾病的治疗，如脑外伤、脑缺血、出血、帕金森病、老年性痴呆等，但其效果一直欠佳[1]。NSCs的自身内源性因素及所处的微环境调节了干细胞的增殖，决定着神经元的发生、存活、分化，是影响细胞替代疗法应用的关键。研究表明，细胞黏附分子TAG-1表达于多种神经元和胶质细胞，与神经元轴突生长相关，参与神经发生和微环境的调节[2-3]。本试验

3、探讨体外培养成年小鼠脑室下区（subventricularzone，SVZ）NSCs是否表达微环境蛋白分子TAG-1，并探索其对NSCs分化的影响，为将来更有效的NSCs的替代疗法奠定理论基础。1材料与方法1.1试剂与仪器实验用动物为2～4个月大的昆明小鼠，体重20～25g，由南方医科大学实验动物中心提供。细胞培养所需的DMEM/F12培养基、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、胰酶等均购自Invotrogen公司；兔来源TAG-1抗体购自Sigma公司，HRP标记二抗购自SantaCruz，Hochest与nestin抗体购自Abcam，荧光二抗购自Inv

4、itrogen公司，TAG-1慢病毒及对照由百诺生物公司提供，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，Trizol与实时定量PCR试剂盒购自takara，PCR仪使用bioradC1000，荧光显微镜为德国Leica公司生产。1.2方法1.2.1NSCs的分离和培养对昆明小鼠用1.5%戊巴比妥钠0.1mL/20g麻醉，在无菌条件下取出侧脑室下区外侧壁，置于预冷的磷酸酶消化液（PBS）中。加入胰酶消化并轻轻将组织吹打成小块，在37℃下孵育108min，期间多次吹打混匀，使组织消化成单个细胞。加入NSCs完全培养基终止消化，常温3000r/min离心3min。弃上清，加入培养基洗涤一次

5、，再次以3000r/min离心3min。弃上清，加入培养基轻轻重悬细胞，移入培养瓶中培养。NSCs完全培养基为DMEM/F12（1∶1），每50毫升中添加青霉素-链霉素500μL，N2500μL，B271μL，bFGF20μg/L，EGF20μg/L，携带TAG-1的慢病毒感染。对照组使用未携带质粒的病毒进行感染，感染复数（MOI）值=20，感染后3d收集细胞。1.2.2免疫荧光细胞预先接种于包被了多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃片上，取出培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）轻洗2次。用4%多聚甲醛室温下固定15min。用PBS漂洗（5min×3次），用10%山羊血清在室温下封闭1h；加一抗

6、nestin（1∶300），4℃下孵育过夜。用PBS漂洗（5min×3次），加相应的二抗室温孵育1h。用PBS漂洗（5min×3次），封片，在荧光显微镜下观察。1.2.3Westernblot在冰上用RIPA缓冲液提取蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的蛋白转移至多氯二苯呋喃（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入TAG-1抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜（5min×3次），加入相应标记的HRP二抗，室温孵育2h。TBST洗膜（5min×3次），ECL化学发光法显影。1.2.4SYBRGreen实时定量PCR技术Trizol法提取RNA，逆转录使用fermentas

7、逆转录试剂盒。Realtime8PCR试剂盒购自天根生化公司，按说明书操作。采用SybrGreen两步法，95℃15min，95℃10s，60℃30s，40个循环。使用引物见表1。1.3统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学分析，Westernblot结果扫描灰度值以后与GAPDH的比值计算，实时荧光定量PCR结果以2-△△Ct法分析目的基因与GAPDH的相对表达量，并进行t检验。P　　3讨论Reynolds等[4]从成年小鼠纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖，