不同培养体系下小鼠神经干细胞增殖和分化潜能的研究

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1、贾磊中文摘要不同培养体系下小鼠神经干细胞增殖和分化潜能的研究专业：干细胞与组织工程硕士研究生：贾磊导师：项鹏教授中文摘要神经干细胞(Neuralstemcells，NSCs)是多能干细胞的一种，具有干细胞的两个摹本特性：自我更新能力和多向分化潜能。在哺乳动物中，神经干细胞存在于发育中的神经系统和成年神经系统的侧脑室F区和海马，在体外不仅具有自我更新能力，而且在一定的诱导条件卜．可分化为神经系统的三种主要细胞：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs这些特性决定了它在基础研究和临床应用方面具有广阔的前

2、景。～方面，对于神经干细胞的研究有助于我们认识中枢神经系统生长、发育、分化等基本牛命规律，阐明诸如神经退行性疾病、神经免疫性疾病等的发病机理，还可作为药物和功能基因筛选的理想研究平台；另～方面，研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用于细胞治疗疾病。人们已经把NSCs视为中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料，为神经退行性疾病(01帕金森，老年性痴呆等)和神经系统损伤(如中风，脑缺血，脊髓损伤等)的功能重建带来了希望。但是目前已有的研究显示，NSCs在体外扩增的能力有限，而且随着传代次数的增加，分化能力和

3、增殖能力下降。因此，深入研究NSCs的增殖、分化等基本生物学特性，建立有效的体外扩增体系，对于NSCs的应用具有重要的科学意义和实用价值。自1992年ReynoldsBA[II建立神经干细胞悬浮培养体系(即神经球培养体系)以来，该培养方法一直被沿用至今。神经干细胞以细胞团(即神经球)的形式悬浮生长于无血清的培养液中。但悬浮培养的神经干细胞具有相互聚一T一贾磊中文摘要集的倾向，神经干细胞、向特定方向分化的神经前体细胞以及终末分化的细胞共同构成了神经球这样一个复杂的细胞群体【2J。为了更好的了解体内神经系统

4、乍长、发育、分化等基本的生命规律，了解体外不同培养条件下神经干细胞增殖、分化的生物学规律13】，我们建立了贴壁培养(即单层培养)和克隆培养体系。在贴壁培养条件下，神经干细胞呈单层贴壁伸展的状态牛长于无血清的环境中，细胞不再聚集成球，这种扩增形式便于我们采用RNA干扰、免疫组化等技术对增殖、分化相关基因、蛋白质进行定位、定性和定量的研究，为深入探讨神经发育、神经分化等相关基因的功能提供了良好的细胞模型【41。而克隆培养体系【31则是更为客观的探讨神经干细胞的牛物学特性的工具，该体系对于帮助我们初步阐明神经

5、干／祖细胞(NSCs／NPCs)增殖、分化的机理，神经干细胞的分裂模式，认识神经干细胞生长、分化及神经系统的发育等生命规律，获取大量背景较纯的神经干细胞群体用于干细胞替代治疗奠定了坚实的基础。全文包括两个部分：第1部分神经球、贴壁及克隆培养体系的建立1．1．目的：从C57／BL6小鼠的胚胎(胚胎12．5天～17．5天)脑皮质中分离NSCs；建立稳定可靠的悬浮、贴壁和克隆培养体系；1．2．方法：1．2．1．在体视显微镜下从胚胎12．5天～17．5天的鼠脑中分离NSCs。1．2．2．将所获得的原代神经干细胞

6、分别采用悬浮和贴壁培养法培养扩增NSCs，并观察NSCs的生长状态。1．2．3．悬浮培养的NSCs经过2～3次传代培养后，消化NSCs为单个细胞，接种于96孔板进行克隆培养，镜下观察记录每孔情况，每7天观察一次。1．2．4．经克隆培养获得第一代克隆后，重复1．2．3进一步亚克隆，以获得第二代及第三代克隆。一TT—贾磊中文摘要1．3．结果：1．3．I．成功建立了稳定的悬浮培养体系：原代细胞接种后2～3天即可看到神经球(约由3—20个细胞组成，细胞之间彼此连接形成球形结构)形成，悬浮于培养液中，周围有死的组

7、织或者细胞碎片。碎片在传代过程中逐步减少，3代以后基本干净。第5天神经球明显变大。若不及时传代，神经球就容易衰亡，球中心变黑(图1．1)，不容易消化成单个细胞。1．3．2．成功建立了稳定的贴壁培养体系：原代细胞在接种到多聚鸟氨酸／纤维连接蛋白包被的组织培养皿上培养24小时后，细胞贴壁伸展，胞体较圆而两端细长(图l-2)。细胞贴壁后每2天换液一次，在细胞密度达到80％～90％左右传代。如果不及时传代，细胞密度过高，贴壁的部分细胞会漂浮起来，聚集成球或衰老夕E亡。1．3．3．成功建立了稳定的克隆培养体系：克

8、隆培养的单个神经干细胞在接种后7天观察有神经球形成(图l一3)，也有部分神经球贴壁生长。经过一个月左右的培养，有部分细胞株增殖N(1～2)×106，将获得的克隆来源细胞进行两次亚克隆培养获得了含有足量细胞的第二代和第三代克隆。1．4．结论：1．4．1．成功地从胎鼠(胚胎第12．5天～17．5天)脑皮质中分离出NSCs。1．4．2．成功地采用悬浮培养、贴壁培养和克隆培养体系体外扩增神经干细胞，并通过克隆培养体系获得足量的第一、第二和第三代克隆