不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响

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1、不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响　　Abstract：ObjectiveTofindtherelationshipbetousefibroblastountoftheoutcelltypeIcollagenfibersousetypeIcollagenElisakit,andtheexpressionofαsmoothmuscleactin(αSMA)testedbyimmunochemistry.ResultsA,positivecorrelationouseαSMA.ConclusionAttheoriginalaugmentation

2、ofthebloodglucose,theproliferationoffibroblastisnotdifferent.Butfibroblasttomyofibroblast,andtheconcentrationofglucoseispositivelycorrelatedoothmuscleactin,αSMA）被普遍认为是肌成纤维细胞表型的可靠证据。本实验利用小鼠成纤维细胞培养，在体外模拟高血糖的环境，设定不同糖浓度，研究不同时间下成纤维细胞生长增殖情况和胶原合成情况，从而为了解不同糖浓度下成纤维细胞增殖情况奠定体外试验基础。　　材料与方法　　1主要试剂

3、　　胎牛血清高糖DMEM培养基（购自Gibico），CellCountingKit8试剂盒(购自碧云天试剂公司)，羊抗小鼠I型胶原抗体，羊抗小鼠肌动蛋白单克隆抗体（购自Santa），兔抗羊二抗（购自Santa）小鼠I型胶原ELISA试剂盒（购自Sygma）。　　2实验方法　　2.1成纤维细胞的原代培养取健康试验用家鼠（昆明小鼠），处死后将背部皮肤毛发刮去，酒精消毒，取3cm×3cm大小皮肤，用无菌剪刀剪去皮下脂肪组织，将皮肤剪碎后散落在无菌培养皿中，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中，培养1周左右，带成纤维细胞迁出组织块后，剔去大块组织，继续培养，并传代多

4、次后纯化等到成纤维细胞。　　2.2不同浓度糖培养液的制备普通高糖DMEM培养基葡萄糖含量为25mmol/L（每升培养基含葡萄糖4500mg），加入一定量左旋葡萄糖后过滤，配置成糖浓度梯度为25、40、55、70、85mmol/L的培养液，其渗透压按照分别为5311、5603、5896、6181、6474mmHg，在正常值5311～6227mmHg范围内或稍高。依次为A、B、C、D、E5个糖浓度组，按照普通组即A组相当于正常血糖值餐后高值7mmol/L，即各组相当于血糖值的7.0、11.2、15.4、19.6、23.8mmol/L。　　2.3成纤维细胞的鉴定和Ⅰ型胶原

5、的组织学观察采用爬片法，使成纤维细胞在特制放滑玻片上生长，待细胞生长到约占70％时，取出玻片，采用细胞免疫组化法（一抗为羊抗鼠I型胶原单克隆抗体，二抗为兔抗羊单克隆抗体）染色（购自Santa）。　　2.4成纤维细胞增殖的CCK测定使用CCK8试剂盒检测(购自碧云天试剂公司)。将细胞消化后加入到96孔板中，每孔加入100μl2000个细胞，过夜，待细胞贴壁生长后用A、B、C、D、E5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，每孔加入10μlCCK8溶液，在细胞培养箱内继续孵育0.5～4小时，在450nm测定吸光度（其细胞数量和吸光度成正比）。　　2.5成纤维

6、细胞I型胶原的Elisa测定将细胞消化下后，按照细胞数1×104个/孔接种到48孔板中，过夜，待细胞贴壁生长后用A、B、C、D、E5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，然后用移液管反复吹打孔底，吸上清，用鼠I型胶原Elisa试剂盒测定细胞外胶原的浓度。　　2.6成纤维细胞肌动蛋白的Westernblot将细胞消化下后，按照同样的浓度接种到48孔板中，过夜，待细胞贴壁生长后用A、B、C、D、E5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，吸去上清后将培养皿放置在冰上，假如蛋白提取液提取细胞蛋白质，测定蛋白浓度，经过煮沸、制胶、蛋白上样，冰上电泳后转膜

7、，封闭，加入一抗小鼠肌动蛋白单克隆抗体（购自Santa）和二抗兔抗羊二抗（购自Santa）后，孵育，洗膜，曝光，检测肌动蛋白。　　3统计分析　　实验数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(onewayANOVA)。　　结果　　1成纤维细胞的鉴定和I型胶原的组织学观察　　如图1为未加入一抗的对照组，不仅细胞未被染色，而且细胞间未观察到有被染色的I型胶原，这一点提示成纤维细胞所分泌之I型胶原纤维可能被吹打脱离培养瓶底部，或在体外培养中成纤维细胞分泌I型胶原较少。图2所示，加入一抗和二抗的样本中，成纤维细胞被染成棕色，细胞成多边形和长梭形，细胞较大；证实原代培养