激活态雪旺细胞与几丁糖胶原膜修复周围神经缺损的实验研究

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1、激活态雪旺细胞与几丁糖一胶原膜修复周围神经缺损的实验研究中文摘要引言：周围神经缺损的修复仍是外科领域的一大难题，临床上主要采用自体神经移植的方法修复，但有明显的缺陷。组织工程为修复周围神经缺损提供了新的方法，本研究的目的就是利用激活态雪旺细胞和生物可吸收材料几丁糖一胶原膜构建人工神经，探索一种修复周围神经缺损的有效方法。本研究共分五部分：第一部分改良植块法培养成年大鼠雪旺细胞目的：通过改良植块培养，探索快速获得高纯度成年大鼠雪旺细胞的培养方法。方法：成年SD大鼠20只，分二组，每组10只大鼠，A组改良植块法，B组传统植块法。耿大鼠坐骨双侧坐骨神经剥除外膜

2、后，剪成0．5mm3小块。A组：植块用0．03％胶原酶消化20分钟后培养；B组：植块直接培养。植块隔5天反复培养，传代纯化，共3次。通过细胞计数比较每次植块所得细胞量，雪旺细胞S一100染色测定纯度。结果：改良植块法在细胞数量和纯度上均高于传统植块法，改良植块法第一次植块培养所得主要为成纤维细胞，起到分离成纤维细胞的目的，第二次雪旺细胞纯度较高85％，经纯化后可以达到95％，第三次植块雪旺细胞纯度95％。经3次反复植块就可以完全利用神经植块。结论：改良植块法可以快速获得高纯度的雪旺细胞，方法简单，廉价。【关键词】雪旺细胞；细胞培养；纯化：坐骨神经；第二部

3、分激活态雪旺细胞培养及其增殖规律研究目的：1．利用预变性神经和激活液培养激活态雪旺细胞2．比较激活态雪旺细胞和正常雪旺细胞的增殖能力方法：SD大鼠10只，2009～2509。右侧坐骨神经切断一周后取材，剥除神经外膜，称重，用0．03％胶原酶加激活液(0．iml／ml消化液)，按照改良植块法培养激活态雪旺细胞。左侧坐骨神经取材剥除外膜后称重，称重，用0．03％胶原酶消化，按照改良植块法培养『F常雪旺细胞。比较单位神经所得的细胞量。取1×10。的第二代细胞分别接种35个培养皿，通过各时问点(2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d)计数，绘制生长曲线，

4、计算倍增时间，比较激活态雪＆l：细胞和正常雪旺细胞增殖能力。培养第8天细胞计数后提取蛋白，westernblot法比较两者CDKl的含量。取接种前及培养第14天的雪旺细胞作S—100染色。结果：改良植块第二次培养7天后，每毫克预变性神经可得到7．5×101个激活态雪旺细胞正常神经为1．5×104个正常雪旺细胞。传代培养后，激活态雪旺细胞在培养2天后计数均高于『E常雪旺细胞，具有统计学差异(p<0．01)，激活态雪旺细胞倍增时间5天，正常雪旺细胞为7天，激活态雪旺细胞增殖快于正常雪旺细胞。而且westernblot测定激活态雪旺细胞CDKl含量高于正常雪旺

5、细胞。结论：神经预变性刺激雪旺细胞增殖，利用预变性7天的神经培养可以获得大量激活态sC，而且激活态sC增殖能力均高于正常SC，可能与激活了CDKl有关。【关键词】雪旺细J

6、f：【：细腿揞养；预变性；细胞周期蛋白依赖激酶K‘K第三部分：激活态雪旺细胞GAP43、BDNF、C-JUN、P21mRNA表达研究目的：比较激活态雪旺细胞和m常雪旺细胞GAP43、BDNF、C-JUN、P21基因表达区别，寻找激活态雪旺的marker，分析激活态雪旺细胞增殖及促进神经再生的机制。方法：选取10只SD大鼠，将大鼠右侧坐骨神经切断，1周后取右预变性坐骨神经改良植块法培养激

7、活态雪旺细胞：取左侧正常坐骨神经培养正常雪旺细胞作为对照。自细胞提取mRNA，应用rt—PCR的方法扩增GAP43、BDNF、C-JuN、P2l基因，取PCR产物行l％琼脂糖凝胶电泳，拍照，图像分析计算目标基因和内标基因(GAPDH)PCR产物的吸光度比值，以配对t检验比较。结果激活态雪旺细胞GAI，43、c—Jun、P21PCR产物积分吸光度比值较正常雪旺细胞明显增高，差异有统计学意义(P

8、显，两者有质的区别。结论1．BDNF可以作为激活态雪旺细胞的marker区别于订三常雪旺细胞2．激活态雪旺细胞GAP43、BDNF、c—Jun、P21基因表达增强，可能是其促进神经再生和加速细胞增殖的原因之一。【关键词】雪旺细胞；生长相关蛋白43：脑源性神经营养因子；c—Jun：p21X第四部分激活态雪旺细胞在几丁糖一胶原膜上生长规律的研究目的：研究激活态雪fK白t1胞在几丁糖一胶原膜上的生长规律和亲和力，探索两者构建人工神经的可能性。方法：成年SD大鼠的坐骨神经切断预变性7d，改良植块法培养激活态雪旺细胞。以l×105数量接种于几丁糖～胶原膜上和培养皿

9、。通过相差显微镜观察细胞生长情况，培养2d、4d、6d、8d、10d、12d、1