抗体ProteinA纯化方法.doc

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1、抗体ProteinA纯化一．ProteinA柱子的制备1.配制溶液；结合／洗涤缓冲液：NaCl，0.5M；Na2HPO4，20mM；PH8.0。配制500ml的方法：称取NaCl4.383g，Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。2.制备空柱子（1）先打开用过的PD-10上盖，拿掉上面的盖膜。盖上盖子，摇晃，倒去里面的填料，用PBS清洗3次。（2）用胶带固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。（3）在PD-10空柱子里加入2ml的BindingWashbuffer.

2、结合缓冲液。（4）ProteinA填料混匀，（10ml包装一小瓶）。（5）加入5ml的ProteinA到柱子中。（6）（7）（8）二．纯化步骤1.样品准备；将兔血清与结合缓冲液1：1混合，过滤（防止堵塞柱子）。2.平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过ProteinA柱。3.上样：将准备好的血清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。4.洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。5.收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液（约3-4ml/管），直至漏出液中不含蛋白。测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。（注意

3、：收集管中需事先加入约150ul的1MPH9.0Tris-HCl缓冲液，防止抗体在过酸的环境下失活）6.柱子再生：用5-10倍体积的再生液再生柱子。7.PBS透析收集的抗体。三．试剂的制备1.结合缓冲液1000ml500ml甘氨酸112.6g56.3g氯化钠175.2g87.6g氢氧化钠调PH至9.02.洗脱缓冲液500ml甘氨酸7.507g用盐酸调PH至3.03.再生缓冲液500ml甘氨酸7.507g酸调PH至2.04.称取12.1gTris碱，加80毫升的双蒸水，溶解后用盐酸调节PH8.0，补加到水100毫升，