《硫酸铵纯化抗体》doc版

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1、1.兔抗人IgG抗体的初步纯化(硫酸铵沉淀法）一、基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。二、试剂及仪器1.组织培养上清液、血清样品或腹水等2.硫酸铵(NH4)2SO4

2、3.饱和硫酸铵溶液4.蒸馏水5.PBS(含0.2g/L叠氮钠)6.透析袋7.超速离心机8.pH计9.磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。（一）配制饱和硫酸铵溶液1.将767g(NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(SAS)（4.1mol/L,25°C）.（二）沉淀1.样品（如腹水）20000′g离心30min，除去细胞碎片；2.保留

3、上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。（三）透析1.蛋白质溶液10000′g离心30min（4°C）。弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。四，应用提示（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1.边搅拌边

4、慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1(v/v)；2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；3.3000′g离心30min（4°C），保留上清液；上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；4.上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。

5、纯化产物的鉴定：（1）效价测定:采用间接ELISA法(3mg/L抗原包被,1∶1000开始倍比稀释)检测抗体的效价。（2）Ig亚类(型)的鉴定:用小鼠Ig亚类检测试剂盒鉴定杂交瘤细胞培养上清中mAb的类和亚类。（3）westernblot鉴定抗体特异性:取5μg人IgG经SDS-PAGE后,转移至硝酸纤维素膜上,用50g/L脱脂奶粉室温封闭1h。依次滴加封闭液稀释的5mg/L纯化抗体(室温孵育2h或4℃过夜,洗膜3次)及1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(室温孵育1h,洗膜3次)。最后加DAB显色,观察结果。（4）相对亲和力测定:以I

6、gG与抗体结合曲线上部趋于平坦的一段(平台期)的吸光度值(A)为100%,查出A值为50%点的抗体的浓度,以此来表示各株的相对亲和力。1.为什么需要用透析袋透析？用透析袋透析以彻底除去硫酸氨；2.纯度如何简单鉴定？用BSA试剂盒测定抗体浓度，也可以用考马斯法、紫外法、双缩脲法等测定。3.为什么要进行活性鉴定？进行活性测定可以判定抗体效价，初步确定抗体的稀释倍数，能便于找到最好的稀释倍数，避免背景深等不良影响。5.纯化产物如何保存？注意事项？纯化产物可以冻干保存、过滤除菌后加叠氮化钠4℃保存、或加50％甘油-20℃保存，也可直接置于液氮中保存。