抗体纯化大全.doc

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1、......抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器·组织培养上清液、血清样品或腹水等·硫酸铵（

2、NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS）·蒸馏水·PBS(含0.2g/L叠氮钠)(见附录一)·透析袋·超速离心机·pH计·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS）将767g（NH4）2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1mol/L,....z.......25°C）；其它不同饱和度硫酸

3、铵溶液的配制见表1； 二、沉淀1、样品（如腹水）20000´g离心30min，除去细胞碎片；2、保留上清液并测量体积；3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）；4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析1、蛋白质溶液10000´g离心30min（4°C）。弃上清保留沉淀；2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻

4、底除去硫酸氨；3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1(v/v)；2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；3、3000´g离心30min（4°C），保留上清液；4、上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的；二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫

5、酸氨用量参考表1）；三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd,R.S.,Raymond,C.S.,Ratz,C.AandDunn,D.L(1993)ArapidprocedureforpurifyingIgMmonoclonalantibodiesfrommurineascitesusingaDEAE–disk.Hybridoma....z.......12,135.2、T.G.库珀着，徐晓利主译《生物化学工具》....z.......人民卫生出版（1980），353。（夏泉

6、）表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度（S1）提高到终浓度（S2）时需加硫酸氨的量（g/L）0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%561141441761962092432773133513904304725165616627675786118137150183216251288326365406449494592649295978911231551892252623003403824245206193049619312515819323026730734839

7、0485583193062941271621982352733143564495461243741071421772142522923334265223163941291642002382783194115063163971321682052452853754693265991341712102503394313366101137176214302392336710314117926435334691051432273143470107190275 3572153237361151987715779 第二节....z..

8、.....DEAE离子交换层析法 基本原理 离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。DEAE是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE吸 附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电 点的缓冲液，此时