抗体纯化的方法有哪些.doc

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1、抗体纯化的方法有哪些？抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的抗体大多数是IgG的各种亚型，以及少数是IgM，二者电泳条带分步大致如下：抗体非还原型PAGE/kDa还原型PAGE/kDaIgG15050，25IgM90065，25IgM单体18065，25硫酸铵沉淀法：基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度

2、也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA基本操作：1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白；3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐；4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱；5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度；6.抗体保存浓度在0.1-30mg/mL适宜，-20℃保存不超过一个月，避免反复冻融。亲和层析法基本原理：基因

3、工程改造的proteinA和proteinG能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将proteinA和proteinG结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。成员介绍：proteinA分离自Staphylococcusaureus的细胞壁，分子量42kDa，由spa基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。proteinA的B结构域proteinA的各个结构域proteinA可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔

4、）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的proteinA通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造proteinA含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的proteinA能得到更好的抗体纯化效果。proteinG分离自GStreptococcus的细胞壁，分子量65kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的proteinG去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较pro

5、teinA更强。proteinG的B结构域proteinG的各个结构域还有一种proteinA/G蛋白，是基因工程改造产物，是将proteinA的4个Fc结合结构域与proteinG的2个Fc结合结构域融合表达得到的。proteinA/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。①proteinA亲和层析适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体；基本操作：1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0PBS稀释、培养上清用pH8.0PBS透析或强氧化钠调节

6、；3.过proteinA琼脂糖凝胶柱，pH8.0PBS洗杂；4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液；5.用PBS透析；6.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度。②proteinG亲和层析与proteinA相比，proteinG通常情况下在低pH环境下与抗体结合力较强，不过高pH环境下小鼠IgG1和兔、人的抗体在仍可以与proteinG结合。适用于：小鼠IgG1、大鼠抗体、猴抗体、兔抗体、牛抗体、山羊抗体

7、、马抗体、绵羊抗体；基本操作：1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；2.调节pH到5.0：腹水以10倍体积0.1M醋酸钠（pH5.0）稀释、培养上清以2倍体积0.1M醋酸钠（pH5.0）稀释；3.过proteinG柱，0.1M醋酸钠（pH5.0）洗杂；4.0.1M甘氨酸（pH2.8）洗脱抗体，并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液5.用PBS透析；6.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度。③抗原亲和层析法抗原亲和纯化一般用在多抗的纯化上，这种纯化方式去掉了血清中那些非特异性结合的抗体分子，得到的抗体分子基本上都是

8、能特异性与抗原结合的。抗原亲和纯化需要先将抗原偶联到柱料上，然后通过亲和层析的方式去除非特异性抗体及杂蛋白，得到特异性抗体。通常采用的柱料为溴化氢预处理和N-羟基琥珀酰亚胺预处理琼脂糖凝胶柱料，前者适合偶联大分子，后者适合偶联小分子物