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时间:2018-12-27
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1、(关键词:抗体;抗体的提取与纯化;盐析法;冷酒精沉淀法;DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白;SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化IgG;离子交换层析)精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术,避免蛋白变性。如分离IgG时,多结合使用盐析法与离子交换法,以求纯化。提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。一、盐析法取xml血清加xml生理盐水,于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。↓4℃,3h以上,使其充分沉淀离心(3
2、000rpm),20min,充上清,以xml生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。↓置4℃3h以上,[此时,(NH4)2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1~2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白,以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。↓对PBS充分透析、换液3次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无NH4+为止。取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后,以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。影响盐析的因素很多,如蛋白质的浓度,盐的浓度,饱和度和pH,温度等都可影响盐析的结果
3、,操作时要充分注意(参阅本章第二节)。二、冷酒精沉淀法分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水,调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下,加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%,保持在-5℃。产生的沉淀(A),含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15~20mol/LNaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1,产生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到最终浓度为25%,维持在
4、-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98%IgG。不同动物,IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物:将沉淀(B)悬浮在0℃水中,调节pH到5.1,离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%,保持在–2℃或-3℃低温,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。表2-5从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件物种 pH 沉淀条件 IgG产量 酒精浓度(%) 离子强度 人
5、 5.1 15. 0.01 65山羊 5.2 0 0.01 65家兔 5.2 10 0.01 70大鼠 5.0 15 0.01 50豚鼠 5.1 15 0.01 70三、DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白原理:DEAE-SephadexA-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。PH7.2~7.
6、4的环境中,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG.(一)操作步骤1.DEAE-SephadexA-50预处理 称DEAE-SephadexA-50(下称A-50)5g,悬于500ml蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH15ml的比例,将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并
7、反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理,最后以0.5mol/LNaOH再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。2.装柱(1)将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。(2)将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2~3cm高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min,同时连续倒入糊状A-50凝胶
8、至所需高度。(3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。3.平衡 启开出水口螺旋夹,控制流速12~14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。4.加样及洗脱 启开上口橡皮塞入下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体
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