《抗原抗体的纯化》PPT课件

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1、免疫学检验•掌握各种纯化方法的原理•熟悉各种纯化方法的影响因素•了解各种纯化方法的技术要点2p免疫学检验最重要的元素为抗原、抗体和免疫细胞p免疫学检验最核心的部分为抗原抗体反应(Antigen-antibodyinteraction)p抗原、抗体是免疫反应中最基本的物质因素34p抗原的纯化是制备高效价、高特异性抗体的先决条件p抗体的纯化对提高免疫反应的特异性和敏感性、定量检测抗原极为重要。5表3-1分离纯化方法的比较原理优点缺点应用方法离心力和物离心分离法质沉降系操作简单分辨率低蛋白质分离数的差别操作简单，成

2、本低，分辨率低，纯化蛋白质的分级沉盐析法盐析作用重复性较好倍数低淀脱水作用和对蛋白质有变性蛋白质、多肽、有机溶剂沉淀操作简单，分辨力降低介电作用，成本核酸和多糖法较强常数较高的分级沉淀分子质量有差别分子筛的排分辨力强，不引起凝胶层析法成本高的可溶性物阻作用蛋白质变性质离子基团的分辨力强，分离量费时间，酸碱用可电离的生化物离子交换法交换作用大量大质分离物与配一种配体只分离亲和层析法体间的亲分辨力很强一类物质，生命大分子物质和作用局限性大物质的带电设备简单、操作方生物分子的分离、电泳成本高性质便、分辨率高定性、定

3、量2021-8-466离心分离已成为科学研究中最基本的技术7一、基本原理•离心法是利用旋转运动的离心力、物质的沉降系数和浮力密度的差别进行分离的技术，当物质的粒子以一定角速度做圆周运动时，受到一个外向的离心力。（一）离心力•这种力的大小取决于角速度（，弧度/）和旋转半径，方程式为：22NFmrmr60l式中：：沉降固体颗粒的有效质量（m）；l：离心半径，转子中心轴到沉降颗粒之间的距离(r)；l：离心机每分钟的转数（N）。2021-8-488（二）沉降系数•受离心力作用的分子或颗粒，单位

4、时间内运动的距离称沉降速度。单位离心力作用下的沉降速度称沉降系数，用s表示。•绝大多数生物分子的沉降系数都很小，将s乘1013定义为一个沉降系数单位，用S（Svedberg）表示，•一般S为20℃的纯水中待测物质的沉降系数。213d()10S18式中：d：沉降颗粒直径；δ：沉降颗粒密度；ρ：溶剂液体密度；η：溶剂液体黏度；2021-8-499•（一）差速离心（differentialcentrifugation）是指采用不同的离心速度和离心时间，用不同的离心力，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。•

5、差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。1011•差速离心法分离到的某一沉降物，纯度不高，含有较多杂质。•需在沉淀中加入相同介质使沉淀悬浮，再用较低转速离心，获得较纯的沉淀。•反复多次采用高速、低速离心操作，即可获得较纯的组分。12优点：操作简单、方便；缺点：①分离效果较差，费时，不能一次得到纯品；②管壁效应严重，特别当颗粒很大或浓度很高时，沉淀出现在离心管壁一侧；③颗粒被挤压，离心力过大和离心时间过长，都会使颗粒变形、聚集而失活。13•（densitygradientcentrifugation）是样

6、品在密度梯度介质中进行离心，适于分离密度相近而大小不同的物质。•（isopycnicgradientcentrifugation）适于分离大小相同而密度不同的物质。14三、影响因素p离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度p（一）离心速度•低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min等。•高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如60000×g等。•相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。即：Fc52RCF1.1210nrFg2021-8-415

7、15p依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。•常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时间；•密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间，即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。p离心时间时间过长或过短，都会影响颗粒在离心管内的预期位置，降低分离效果。16•为防止欲分离物质在离心过程中的聚集、变形和失活，离心温度一般控制在4℃左右。•离心速度较低或者物质的耐热性较好，也可以在室温条件下

8、进行。•超速离心和高速离心，转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷冻系统。17•离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定的pH范围内，必要时可用缓冲溶液。•pH过高或过低都可能引起生物活性物质的变形、失活，还可能引起转子和离心机其它部件的腐蚀，应加以注意。18•生物大分子的分离、浓缩和纯化19•通过改变溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技