泥蚶（Tegillarca granosa）血红蛋白基因（Tg-HbIIA）克隆、分析及免疫表达研究.pdf

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1、第43卷第1期海洋与湖沼Vo1．43．NO．12012年1月0CEAN0L0GIAETLIMNOLOGIASINICAJan．，2012泥蚶(Tegillarcagranosa)llll白基l~(Tg．HblIA)克隆、分析及免疫表达研究术汪青，2林志华①包永波①霍礼辉，顾海龙，2(1．浙江万里学院生物与环境学院宁波315100；2．上海海洋大学水产与生命学院上海201306；3．宁波大学生命科学与生物工程学院宁波3152111提要通过已构建的泥蚶血液eDNA文库，克隆得到泥蚶Tg．HblIA基因全长cDNA序列，对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明，泥蚶T

2、g—HblIAeDNA全长73lbp，包含63bp5，非编码区(5'-UTR)，246bp3非编码区(3'-UTR)，开放阅读框450bp，编码150个氨基酸；其氨基酸序列与毛蚶(Scapharcakagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharcainaequivalvis)的序列有较高的同源性，分别达到89％和88％；对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域，含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示：泥蚶不同组织部位中，Tg．HblIAmRNA在血液表达量最大，其次为外套膜和鳃，表达量最低的是肝胰脏；在副溶血弧菌(Vibrioparahaemol

3、yticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后，泥蚶血液Tg-HblIAmRNA表达量显著上调，表明Tg．HblIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用，而Tg—HblIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。关键词泥蚶，血红蛋白，菌刺激，mRNA表达免疫反应中图分类号Q789泥蚶(Tegillarcagranosa)俗称血蚶、花蚶、粒蚶polyphemus)、龙虾(Pacifastacusleniusculus)、章鱼等，隶属于瓣鳃纲，是我国传统养殖贝类之一(孙长(Octopusvulgaris)和红皱岩螺(Rapanavenosa)等无脊森等，2010)，广泛分布于山

4、东、浙江、福建、广东等椎动物的血细胞中，血蓝蛋白也具有酚氧化酶或类地，浙江是国内泥蚶养殖面积和产量最大的省份。近酚氧化酶活性，可以杀灭细菌(Asp／metal，1991；Sal—年来养殖泥蚶病害死亡频发，因此，开展泥蚶免疫发vatoetal，1998；Deckeretal，2001；Dolashkietal，生机制和调控机理的研究对发展泥蚶健康养殖具有2011)。本研究以泥蚶为对象，对泥蚶血红蛋白重要意义。孙虎山等(2001)和刘世良等(2003)认为贝Tg—HblIA基因进行克隆与分析，并进行组织表达和类血细胞与脊椎动物血液内的免疫细胞相似，承担免疫相关分析，为探索贝类血

5、红蛋白进化和抗菌免部分免疫功能。Jiang等(2007)研究发现人血红蛋白具疫机制等提供参考。有潜在类酚氧化酶活性，能有效杀灭金黄色葡萄球1材料与方法菌(Staphylococcusaureus)和铜绿假单胞菌(Pseudo—monasaeruginosa)等细菌；Nedjar—Arroume等(2008)1．1泥蚶Tg—HblIAcDNA全长克隆及核酸与氨基酸发现牛血红蛋白水解片段对藤黄微球菌A270(Mi．序列分析CFOCOCCUSluteusA270)等具有抑制作用，说明哺乳动通过EST序列分析，发现一个477bp的EST序物血红蛋白具有一定的抗菌免疫作用。鲎(Lim

6、ulus列与毛蚶(Scapharcakagoshimensis)fill红蛋白HblIA国家自然科学基金项目，31001097号；浙江省自然科学基金项目，Y3100087号；国家贝类产业技术体系项目，CARS一48号。汪青，E—mail：yiyibajiul189@126．corn①通讯作者：林志华，E-mail：zhihua9988@126．corn；包永波，E—mail：bobbao2001@gmail．corn收稿日期：2010—09—21，收修改稿日期：2O11—01．041期汪青等：泥蚶(f，口口D口)血红蛋白基因(Tg—HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究89序

7、列高度相似(89％)，以此EST序列设计特异引物为0．2mg／m1)，另取50个泥蚶注射灭菌海水作为对照Tg—HblIA—F，R克隆Tg—HbIIA基因。见表1。用Tg—组。在注射后Oh、1．5h、3h、6h、12h、24h、48h每HblIA．R和通用载体引物T3进行5'RACE反应，94℃组分别抽取四个健康样本血液，并离心1000g10min40s56℃40s，72℃1rain，72℃延伸10min；用Tg—收集血细胞。另取弧菌注射12h后的四个样本的6种HblIA．F和通用载体引物T7进行3'RACE反应，程