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《芦荟苦素对黑素细胞与角质形成细胞混合培养模型中黑素合成的影响.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、芦荟苦素对黑素细胞与角质形成细胞混合培养模型中黑素合成的影响芦荟苦素对黑素细胞与角质形成细胞混合培养模型中黑素合成的影响［摘要］目的：体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，观察芦荟苦素、熊果甘及茶多酚对此模型中黑素细胞的影响。方法：以包皮组织作为细胞来源，分别培养角质形成细胞、黑素细胞；体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型,检测芦荟苦素、熊果甘及茶多酚作用于此模型后对黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果：黑素细胞与角质形成细胞混合培养5天后出现浅灰色，继续培养，颜色逐渐加深。三种退色剂对酪氨酸酶活性及黑素的合成
2、均呈浓度依赖性抑制。结论：成功构建了黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，三种退色剂均对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成产生浓度依赖性抑制，以茶多酚作用最强,芦荟苦素次之。［关键词］混合培养模型；黑素细胞；角质形成细胞；芦荟苦素；熊果甘；茶多酚［中图分类号］Q343.6［文献标识码］A［文章编号］1008-6455(2007)03-0310-03黑素是决定皮肤颜色的最主要因素，生理情况下角质形成细胞(KC)通过分泌一些生长因子或细胞外基质成分，直接或间接地对黑素细胞形态、黑素合成和转运等活动进行调节。酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，催化酪氨酸羟
3、化为多巴并进而形成多巴醍的反应，该酶的活性大小决定着黑素合成的数量。由于酪氨酸酶在黑素合成中的重要作用，许多退色剂通过抑制酪氨酸酶活性，从而减少黑素的形成。本实验以儿童包皮为组织来源分离培养的黑素细胞、角质形成细胞来“表皮黑素单元”的结构，在此基础上，研究了芦荟苦素、熊果昔与茶多酚对黑素细胞(MC)的影响。1材料和方法1.1材料1.1.1标本：取自包皮环切术切除的包皮组织(儿童：7〜10岁)。1.1.2主要试剂与仪器：芦荟苦素(aloesin)购自深圳市荣格生物化学制品有限公司；熊果(arbutin)购自北京贝丽莱日用化工厂；茶多酚(TP)购自安徽红
4、星药业有限责任公司；霍乱毒素(CT)、左旋多巴(L—Dopa)>Dispase酶、转铁蛋白购自美国Sigma公司；碱性成纤维细胞生长因(bFGF)购自珠海亿胜生物制药公司；重组人表皮生长因子(EGF)购自深圳市华生元基因工程发展有限公司；小鼠抗人细胞角蛋白单抗AE1/AE3、SP奥抗试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中山。高通量多功能微板测试系统Biotrak-2英国Amersham□1.2实验方法1.2.1黑素细胞与角质形成细胞的混合培养模型的建立：鼠尾胶原溶液的制备参照文献。以KGM-G7F培养液(DMEM/F12(3:1),10%(v/v)胎牛血
5、清,腺噤吟0.18mM,EGF10ng/ml,氢化可的松0.411g/ml,胰岛素5ug/ml,异丙肾上腺素10uM,转铁蛋白5ug/ml,三碘甲状腺原氨酸2nM,氨节青霉素lOOug/ml,硫酸链霉素lOOug/ml培养角质形成细胞；收集真皮，剪碎，采用组织块法培养以获得成纤维细胞。向生长接近80%融合的成纤维细胞中加入丝裂霉素，最终浓度为lOug/mL在孵箱中孵育4h,用无钙镁PBS洗2次，加入0.25%的胰酶消化、离心、重悬后计数，以1.OX104/ml接种于已预铺胶原的24孔培养板内，培养液为DMEM+15%小牛血清，隔
6、口使用。取生长状态良好的黑素细胞和角质形成细胞，常规消化、离心,细胞记数后以KGM-G7F培养液重悬，将两种细胞悬液混合，调整角质形成细胞浓度为1.0X105/mK黑素细胞浓度为0.3X105/mlo将24孔培养板中的培养液吸弃，每孔加入细胞悬液1ml,于50ml/LC0237°C孵箱内培养，每2天换液…次，同时倒置显微镜下观察细胞接种后的生长状况。1.2.2药物处理与实验分组：药物溶液根据根据文献的方法方法配制实验药物分为芦荟苦素、熊果昔、茶多酚共三大组，对照组以PEH代替，吸弃上清
7、液，每孔加入KGM-G7F900u1及药物溶液lOOu1每组药物最终浓度分别为1,0.1,0.01g/L,每一浓度6个孔。对照组每孔加KGM-G7F900u1和100u1100ml/LPEH共6个孔。1.2.3酪氨酸酶活性测定：参见文献的方法。酪氨酸酶活性抑制率二（1一各浓度平均吸光度值：对照组平均吸光度值）X100%o1.2.4黑素含量测定：黑素含量采用NaOH方法测定：药物作用一周后，三种药物各浓度及对照组均取3孑L,弃上清液，0.Olmol/L的PBS洗2次,每孔加入1mllmol/L的NaOH,震荡5min,每孔中的原液吸取200111分别加
8、入96孔板的两孔之中，选择405nni波长在高通量多功能微板测试系统上测吸光度值。黑素合成抑制率二［（对照组
