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《白介素-1对培养人表皮黑素细胞增殖及黑素合成影响探究.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、素合成影响探究［摘要］目的：建立正常人表皮黑素细胞体外培养体系，观察不同浓度的白介素Ta,白介素-IB对体外培养正常人黑素细胞的细胞增殖及黑素合成的影响。方法：采用四甲基偶氮p坐盐(MTT)法测定白介素-la及白介素TB对黑素细胞增值的影响，NaOH裂解法测定黑素生成量，流式细胞仪检测黑素细胞的凋亡率。结果：白介素Ta及白介素-IB对黑素细胞活力有抑制作用，能使细胞增殖能力降低，黑素合成减少，增加黑素细胞的凋亡率。结论：白介素Ta及白介素-1B对体外培养的黑素细胞增殖及黑素生成都有抑制作用，这为临床应用白介素Ta及白介
2、素TB治疗色素性疾病提供了实验依据。［关键词］白介素-la；白介素-1B;黑素细胞［中图分类号1R758［文献标识码］A［文章编号］1008-6455(2012)06-0952-04黑素的合成是个极其复杂的过程，在体内受金属离子、细胞因子、激素等各种因素的调节。多种细胞因子对于黑素细胞的数量、形态、酪氨酸酶活性、细胞间粘附分子-1等均有不同程度的影响［1］。IL-1是一个多功能的促炎症细胞因子家族，几乎所有有核细胞均能产生IL-1。为了研究白介素-1(Interleutin-1,IL-1)对人表皮黑素细胞增殖及黑素合成
3、的影响，为临床应用IL-1治疗色素性疾病提供实验依据，笔者建立了正常人表皮黑素细胞体外培养体系，采用不同浓度的白介素-la及白介素-IB作用于体外培养的黑素细胞，观察了IL-la及IL-1B对表皮黑素细胞增殖及黑素合成的调节作用，现将结果报道如下。1材料和方法1.1材料及仪器：MCDB-153培养基，牛胰岛素，人转铁蛋白,L-Dopa,IL-la,IL-13,DMSO,MTT均购自美国Sigma公司。重组人表皮生长因子(rhEGF)购于美国Peprotech公司。牛垂体提取物(BPE)购于美国Invitrogen公司。
4、10%新生小牛血清购自Hyclone公司。EDTA~Na2购自美国Gibco公司。氢化可的松0.5ug/ml,青霉素100IU/ml,链霉素100IU/ml,胰蛋白酶，苔盼兰均系国产。培养瓶、96孔板和6孔板均购于美国Corning公司；显微镜：观察细胞用的是OLYMPUSCK2型号；细胞计数用的是OLYMPUSCKX41型号，照相用的OLYMPUSCH2型号；酶联免疫检测仪；流式细胞仪。标本经患者知情同意后取自18〜35岁行包皮环切术的正常人包皮。1.2方法1.2.1正常人黑素细胞的培养[2-3]:将上述包皮标本消毒
5、、修剪，用含0.2g/LEDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化和离心后，将获得的MC进行培养。在倒置显微镜下观察，细胞呈明显的两极或多极树突形态。1.2.2黑素细胞鉴定[4-5]1.2.2.1L-Dopa染色：将传代纯化后的黑素细胞，经含0.2g/LEDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化后接种于已预先放置盖玻片的6孔板内，待细胞贴壁并稳定生长后弃去培养液，并用预热的PBS液洗涤数次。用2.5g/L戊二醛固定后，加入用黑素细胞培养液配制的lg/LL-Dopa,37°C孵育4h,其间换液1次，风干后甘油封片，照相。1.
6、2.2.2Fontana银染：在0.15%硝酸银溶液中加入适量氨水配制成氨银液，将传代纯化的黑素细胞用戊二醛固定后加入氨银液，避光浸染约30min,PBS液漂洗3次后置倒置显微镜下观察，照相。1.2.2.3S-100蛋白免疫组化染色：将传代纯化后的黑素细胞，经消化后接种于已预先放置盖玻片的6孔培养板内，待细胞贴壁后去掉培养液。用2.5g/L戊二醛固定后，PBS液洗涤数次，加入3%的H202,室温30min,以去除内源性过氧化物酶；再次用PBS液洗涤数次，滴加1：20稀释的羊血清，室温下处理15min；加入1:200兔抗
7、S-100蛋白的多克隆抗体，41过夜；洗涤后加入生物素标记的羊抗兔抗体，37£、湿盒孵育lh,再次洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37°C.湿盒孵育lh。洗涤后DAB染色，蒸饱水适时终止，苏木素复染后用加拿大胶封片，照相。1.2.3黑素细胞增殖的测定：采用四甲基偶氮哇蓝比色法（MTT法）。倒置显微镜下观察，细胞培养至80%汇合时,弃培养液上清，加入含0.2g/LEDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶共1〜1.5ml,在75cm2的细胞培养瓶内37£孵育3〜5min,镜下观察约80%脱落，加入5ml左右的含有10
8、%新生小牛血清的MDCB-153培养基终止消化，转移细胞悬液到15ml离心管，1500rpm离心3min,弃去上清，加入适量含有10%血清的MDCB-153培养基重悬细胞团块，吸取100H1到一个无菌的500u1的EP管中，加入等量的0.8%的苔盼兰溶液，室温下混匀5min,吸取100y1混合液于血细胞计数板计数。按20000个/
