hacat细胞与黑素细胞体外构建含黑素的组织工程皮肤

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1、《中国图书资料分类法》单位代码：10660分类号：R75学号：S100261贵阳医学院2013届硕士学位论文HaCaT细胞与黑素细胞体外构建含黑素的组织工程皮肤研究生：李智昊导师：陆洪光教授年级：2010级专业：皮肤病与性病学2013年5月30日贵阳医学院2013届硕士研究生论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„„„1前言„„„„„„„„„„„„„„„„2材料与方法„„„„„„„„„„„„„„3结果„„„„„„„„„„„„„„„„9讨论„„„„„„„„„„„„„„„„15参考文献„„„„„„„„„„„„„„„18英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„20致谢„„„„„„„„„„„„„„„

2、„22略缩词表„„„„„„„„„„„„„„„21论文原创性声明„„„„„„„„„„„„23附：综述„„„„„„„„„„„„„„24贵阳医学院2013届硕士研究生论文HaCaT细胞与黑素细胞体外构建含黑素的组织工程皮肤专业：皮肤病与性病学研究生：李智昊导师：陆洪光教授摘要目的探究用永分化的人角质形成细胞（HaCaT）和黑素细胞（Melanocytes,MCs）混合培养接种于去表皮的真皮(De-epidermizeddermis,DED)，体外构建含黑素的组织工程皮肤。方法1．采用两步酶消化法处理健康小儿包皮，获得表皮细胞悬液，用改良的M254黑素细胞培养基培养MCs。2．将中国医科大学馈赠的

3、HaCaT细胞复苏。3.分别将HaCaT、MCs传至第3代。4．将培养第3代的HaCaT、MCs细胞以10：1比例制作细胞爬片，1天后进行Masson-Fontana染色。5.制备人去表皮的真皮(DED)，分别将培养第3代的HaCaT、MCs制成细胞悬液，按照10：1的比例接种于DED表面，采用液下培养3天后，改为空气一液面培养相结合的方式进行培养，每3天换液一次，2周后取培养的组织工程皮肤分别做HE染色、硫酸亚铁染色、HMB45和角蛋白免疫组化鉴定并取先前做过的KCs和MCs共培养的工程皮肤做比较。结果1.HaCaT、MCs混合培养于爬片1天后，于倒置显微镜下观察到HaCaT呈铺路石状生

4、长，其间散布MCs，MCs树突延伸到HaCaT细胞间。2.两种细胞混合接种于DED，15天后HE染色显示在DED上有3～6层表皮细胞,并可见角质层,角蛋白免疫组化染色阳性，硫酸亚铁染色显示全角质层可见散在黑素着色。结论MCs、HaCaT混合接种于细胞爬片中可构建MCs和HaCaT接触生长的单细胞层，将MCs、HaCaT接种于DED可构建含有黑素成分的组织工程皮肤。关键词:黑素细胞；角质形成细胞；HaCaT；去表皮的真皮；组织工程皮肤1贵阳医学院2013届硕士研究生论文前言人表皮中的黑素细胞(Melanocytes，MCs)是表皮产生色素的细胞。它源于神经脊。在正常成人表皮，黑素细胞与基底层

5、角质形成细胞（Keratincytes，KCs）按1：10的比例存在于基底层中。MCs顶部可见数个突触，每个突触可与10～36个KCs接触，形成黑素单元。MCs的主要功能是黑素小体合成黑素颗粒并传递给KCS，保护KCs和免受紫外线辐射损害。MCs与KCs之间不光有黑素颗粒的传递，还可通过旁分泌相互释放某些[1-4]因子来影响其各自的生长，分泌及抗原的表达。20世纪70年代，国外专家就建立了[5]二维平面共培养体系，但与正常皮肤生理体系还存在一定差距。近年来随着体外细胞培养技术和真皮替代物的发展迅猛，这为建立类似于人表皮的组织工程皮肤提供了必要的技术支持。但目前所见报道的组织工程皮肤一般为单

6、一细胞成分，与正常组织有较大差异。近来，人们探索用三维模型体外构建有KCs和MCs成分的人工皮肤，取得了一定[6]进展。但是，由于所用细胞系、真皮替代物、培养基及培养方法的不同，所获得的人工皮肤结构和功能存在异质性。我们以往曾报道用人去表皮的真皮（De-epidermized[7]dermis,DED）体外构建组织工程皮肤。也成功构建了KCs和MCs的二维平面和三维组[8,9]织工程皮肤。DED为富含胶原的三维结构，并保留Ⅳ型胶原、板层素等基底膜成分，可诱导种子细胞的发育和分化，在体外皮肤重建中具有较高的应用价值。本研究将以包皮为组织来源分离培养出的MCs。将其与HaCaT混合接种于细胞爬

7、片中来构建MCs和HaCaT接触生长的单细胞层，并将MCs和HaCaT按照一定比例混合接种于DED，进行组织培养，体外构建含有黑素成分的组织工程皮肤，现将结果报道如下。2贵阳医学院2013届硕士研究生论文材料和方法1.材料1.1主要的仪器和设备：CO2细胞培养箱Thermo公司，3111型倒置显微镜尼康，TE2000-U＋DXM1200自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂，SZ-93型台式离心机湖南湘仪科学仪器厂，TDZ