细胞培养的应用(讲座).doc

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1、细胞培养的应用（讲座）摘要：细胞培养是生物医学中的一项重要技术，本文简介其在细胞生物学、生物化学、临床检验学等领域的应用。关键词：细胞培养中图分类号：R446.11+3文献标识码:C文章编号：1006-29631细胞培养细胞培养是生物医学中的一项重要技术，应用较为广泛，渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等各个领域。1.1细胞的来源可直接来自人或动物组织，也可间接来自于细胞系。前者直接来自生物体，各项生物指标更接近于在体情况；但一般细胞的提取过程较繁冗，而且大多数细胞只能原代培养或只能传1~2代，如人血管内皮细胞、小鼠神经细胞等；细胞系的好处是较为方便，可直接

2、购买使用，免去了分离过程，一般可较稳定地传代，但其生物学指标与在体情况有一定差异。1.2细胞培养的实验室要求细胞培养要求较高，目的是使细胞能在无菌条件下存活。提取细胞的手术器具在每次使用之前应高温、高压消毒，配培养液的水要求用灭菌双蒸水并加入双抗。所用培养瓶、离心管等器皿最好为一次性。要在无菌室超净台上操作。每次操作之前，要用紫外灯照射工作台20-30min,然后将手洗干净，换拖鞋进入无菌间，将手用新洁尔灭喷洗一遍再操作。2以人血管内皮细胞为例说明细胞培养由于细胞本身姓质不同，其分离和培养方法也会有差异。其来源一般是新鲜脐带的脐静脉（来自于产后24h以内），具体

3、的分离方法是取新生儿脐带血（25cm左右），放入含青、链霉素各100U/mL的灭菌PBS中，4P保存，24h内进行实验。2.1.取材和原代培养在脐静脉的两端各插入一支磨平的注射器针头，用止血钳夹住脐带以防针头滑出，用注射器从异端的针头注入PBS冲洗血管，直到流出PBS无明显血迹，用PBS将残留血液冲洗干净，以充分暴露内皮细胞。注入0,1%（g/L）胶原酶溶液（用PBS配制），待血管内残留PBS流尽后，用注射器封住另一端针头，继续注入胶原酶，充盈血管，于室温下消化20-30min,掌握好消化时间，否则，时间太短会致消化不完全，造成浪费；时间太长，可能会将平滑肌细胞

4、一并消化下来，造成生物污染，干扰内皮细胞的生长。将消化液打入无菌的离心管中，离心（800r/min,8min）。轻轻吸出上清液，加5mL培养液于离心管中悬浮细胞。加2mL纤粘连蛋白（1mg/mL）于培养瓶中，铺均匀后，吸出剩余液体，放置片刻，将细胞种入培养瓶，XCO2孵育箱培养，24h后换液一次，以后每48h换液一次，4-6天汇合成内皮单层。消化时间要掌握好，若时间太短会致消化不完全，造成浪费；时间太长，又会将平滑肌细胞一并消化下来，造成生物污染，干扰内皮细胞的生长。2.2.传代当培养瓶内内皮细胞形成致密单层时，进行传代。PBS冲洗细胞2次，加0.125%（g/

5、L）胰蛋白酶/0.02%（g/L）EDTA・Na21mL消化细胞，显微镜下可观察到细胞立即收缩、变圆，当观察到大部分细胞脱落时即可加入培养液，以终止胰酶的作用，用滴管吹打壁上的细胞使其脱落及分离，离心（800r/min,5min）,加入培养液，按1:2比例接种于培养瓶中。2.3冻存内皮细胞生长到一定数量时，暂时不用的细胞，要将其冻存于液氮内备用，即：将胰蛋白酶消化下来的细胞，加入少量培养液后，离心（800r/min,5min）,弃上清液，加入细胞冻存液（含10%［体积分数］二甲基亚飒培养液），将细胞密度调至1。6细胞/mL,置于细胞冻存管中，每管1mL,塞入泡沫

6、塑料盒内（以放慢降温速度），放入・70。（：冰箱过夜，第2天迅速转入液氮中储存。待使用时再将冻存的细胞复苏。复苏时，迅速投入37。（：水浴中并不断振摇，使之迅速融化，离心（800r7min,5min）,弃上清液，以去除二甲基亚石风。加入适量培养液，并在培养瓶中培养。冻存和复苏，简单概括就是要慢冻速融。2.4其他根据要研究的对象和目的的不同以及解决问题的角度不同，来确定要培养哪种细胞。如，要研究动脉硬化的血管相关问题，一般要培养血管内皮细胞；而要研究有关老年痴呆的问题，则一般要培养神经细胞进一步加以研究。确定要培养哪种细胞，后要考虑通过细胞哪些姓质或特点来进行研究

7、。大体上可以根据细胞表面标志或分泌功能来选定研究方法。利用细胞表面标志，可采用细胞免疫化学、免疫荧光等方法；利用细胞分泌功能，可以采用ELISPOT等方法°3细胞培养的应用3.1分子生物学研究不同生物体表达某种物质会有差异，不同细胞也会存在着这种表达上的差异。这种差异到底是来自于基因水平还是直接来自于蛋白水平？可以通过反转录PCR（R「PCR）的方法进一步研究。首先，细胞培养得到足够数量的细胞，将这些细胞的总RNA提取出来，再反转录为cDNA,通过PCR以后，可以将基因水平的差异放大，从而可以明确表达上的差异来自于基因mRNA（转录水平）还是来自于蛋白（翻译水平

8、）。如本实验室研究的糖皮