口腔细胞培养及其应用

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1、（本章所附照片除特别标注外均来自首医口腔基因治疗与牙再生分子生物学实验室）第六章口腔细胞培养及其应用提要：本章介绍细胞培养的基本原理及基本方法；牙齿相关细胞、唾液腺细胞、口腔黏膜细胞、颌骨相关硬组织细胞、口腔肿瘤细胞的培养及特点；组织工程的基本原理、口腔组织特有的干细胞、再生医学技术在口腔医学中的应用；基因芯片、蛋白芯片、组织芯片，蛋白质组学、生物信息学、模式生物学、系统生物学等。重点掌握细胞培养基本原理及方法，口腔医学中相关细胞培养及其特点，了解口腔干细胞培养在口腔再生医学中的应用及口腔生物学其他研究方法。第一节细胞培养一、细胞培养的基本原理第一节细胞培养的基本原理细胞培养的基本概念

2、细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中第一节细胞培养的基本原理体外细胞生物学形态特点贴壁型细胞悬浮型细胞生长增殖过程培养细胞生命期培养细胞一代生存期第一节细胞培养的基本原理贴壁型细胞必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型：上皮型成纤维型游走型多形型第一节细胞培养的基本原理悬浮型细胞于悬浮状态下即可生长不需要贴附于

3、支持物表面多见于血液淋巴细胞第一节细胞培养的基本原理几种常见细胞的形态原代培养神经元细胞（×10）原代培养星形细胞（×10）神经细胞瘤细胞系（×10）N20Y结肠癌细胞系（×10）Caco-2第一节细胞培养的基本原理培养细胞生命期所谓培养细胞生命期，指细胞在培养中持续增殖和生长的时间细胞全部生存过程大致分为以下三个阶段：原代培养期传代期衰退期第一节细胞培养的基本原理原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周传代期：初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，

4、最后衰退凋亡第一节细胞培养的基本原理细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，成为无限细胞系无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。可能恶性变细胞永生性和恶性性非同一性状第一节细胞培养的基本原理第一节细胞培养的基本原理培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，细胞传代后，一般要经过以下三个阶段:潜伏期（游离期，贴壁期）对数生长期停滞期（平台期）第一节细胞培养的基本原理培养细胞一代生存期第一节细胞培养的基本原理细胞生长过程中的重要现象接触抑制：由于细胞的相互接触而抑制细胞运动密度抑制：细胞因营养的枯竭和

5、代谢物的影响而停止生长第一节细胞培养的基本原理培养细胞的体外生长环境无污染环境基质气体环境和氢离子浓度液相环境温度渗透压第一节细胞培养的基本原理无污染环境：高压蒸汽消毒器电热干燥箱滤器超净工作台紫外灯第一节细胞培养的基本原理基质：玻璃基质塑料饲养细胞，又称滋养细胞生物性基质处理培养表面金属第一节细胞培养的基本原理气体环境和氢离子浓度：5%二氧化碳95%空气pH为7.2～7.4第一节细胞培养的基本原理液相环境：水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐液：Hanks液、PBS、Earle液等天然培养基合成培养基无血清培养基第一节细胞培养的基本原理温度维持：（36.5±0.5）℃渗透压：290～

6、320mOsm/kg第一节细胞培养的基本原理细胞培养常见仪器超净工作台细胞培养箱倒置相差显微镜第一节细胞培养的基本原理二、细胞培养的基本方法第一节细胞培养的基本原理无菌操作中的注意事项对实验中可能用到的器具及培养用液进行严格消毒灭菌培养室的消毒：培养室和超净台要用紫外灯和酒精严格消毒进入无菌室前要按照外科手术无菌要求进行洗手与着装培养过程中要注意无菌操作：时刻铭记无菌物品与有菌物品要分开处理第一节细胞培养的基本原理ABA超净工作台中的实验用品要摆放整齐B实验前75%酒精喷洗双手无菌操作技术第一节细胞培养的基本原理CD开启封闭瓶口等操作应在火焰就近的地方，并轻轻灼烧CD第一节细胞培养的基

7、本原理EFEF移液操作第一节细胞培养的基本原理基本培养操作技术培养细胞的取材与分离体外培养细胞的纯化细胞的冻存与复苏第一节细胞培养的基本原理培养细胞的取材与分离取材部位准确严格无菌操作尽快培养减小损伤制备标本第一节细胞培养的基本原理体外细胞的纯化人工纯化：酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪分离法等自然纯化第一节细胞培养的基本原理细胞冻存要点：冷冻过程要缓慢冻存细胞必须处在对数生长期细胞复苏要点：快速解冻解冻后的细