MDCK细胞培养细胞培养.doc

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1、MDCK细胞培养MEM细胞生长液配制500mlMEM液+5ml双抗（青霉素+链霉素）+5mlL■谷氨酰胺+7.5ml碳酸氢钠+50ml小牛血清90%MEM液1%双抗1%L・谷氨酰胺1.5%碳酸氢钠10%小牛血清0.25%EDTA月夷酶（从冰箱取出后放入培养箱屮待用）（1）细胞传代将细胞瓶屮的生长液倒去，加入MEM液（大概6ml左右）清洗，倒去；加入EDTA■肺酶（根据细胞消化情况而加量），倒去；再加入EDTA■胰酶，放置培养箱，进行消化（大概10分钟左右），待其细胞开始脱落后（在细胞瓶屮呈毛玻璃）；吸干EDTA■胰酶倒去，放置培养

2、箱一段时间（细胞呈逐个完整），取岀；【细胞生长好，多，可1传3或者1传4】将配好的细胞生长液吸入，吹打混匀，待完全脱落至过长液屮；将其分装入细胞瓶和细胞板屮。6ml/瓶37°C培养1ml/孔CO2培养箱（用于标本接种）（2）标本处理复融，从・70°C冰箱取出，常温下溶解；充分震荡，后取出试导，至4C冰箱屮，静置20分钟左右；取螺旋管，在其加入（）.2ml的双抗（20%）,后加入1.8ml的病毒液，放置4°C,过夜上毒。（3）细胞上毒（需培养一周）洗细胞，将细胞板（前一天）上的液体（生长液）吸干，加入1ml的MEM,清洗，重复一次，

3、然后吸干；加入处理后的病毒液180ul；放置CO2培养箱中1.5ho将细胞板取；1ml/孑L加入病毒过长液后，放置CO2培养箱，培养一周；并将上周上毒的细胞液取出，放置・70°C冰箱，隔天鉴定。配制病毒过长液：lOOmlMEM屮加入1ml双抗，1mlL■谷氨酰胺1mlTPCK-胰酶1.5ml碳酸氢钠血凝试验：病毒经系列稀释，与一定浓度的红细胞混合，混合液放置在专为血凝试验设计的板的圆底屮，未出现凝集的红细胞可在孔底自由滚动，形成浓密的，极易识别的细胞团，而凝集红细胞不能在池底自由滚动，均匀地覆盖池底。(4)1%人O型红细胞洗涤首先

4、应选择无乙肝病毒携带者的O型血，待其自然沉降后；吸取红细胞层的红细胞置入离心管屮；加入无菌生理盐水至离心管2/3处，两管平衡后，1800r/10min；用无菌吸管吸去生理盐水，再加入生理盐水、混匀；重新离心，重复3次，离心取出后；取细胞瓶，吸取9ml生理盐水；加入1ml的离心好的红细胞，混匀即可。(5)病毒鉴定将病毒培养(・7O°C的病毒细胞培养液)取出，常温下解冻；取鉴定板，将病毒液混匀(2孔合一孔)，滴加3滴病毒液；将洗涤好的1%人O型红细胞，滴加3滴；放置lh后，观察血凝结果。凝集为阴性，扩散为阳性，阳性吸出病毒液4°C冰箱

5、保存，隔天做效价试验。(6)病毒效价测定(血凝试验)从4C冰箱取出前天阳性标本的病毒液室温静置。将病毒培养液，进行倍比稀释：先在A孔中加入lOOul的病毒液;在取50ul生理盐水依次加入B-H孔屮；以A孔中取出50ul加入B孔中,混匀;依次加入各孔做倍比稀释，并做生理盐水对照；加入1%人O型红细胞50ul各孔，混匀静置lh后观察;以呈现完全血凝时的稀释度为该病毒的最大效价。(7)病毒血凝抑制试验(病毒种鉴定)(1)将病毒液根据其效价做1:8浓度；在1・5列屮，分别加入25ul的A,A3,Bv,By,甲型流感血清抗体；从下孔至上，各

6、加入25ul的生理盐水；再从A排・H排做倍比稀释，并除去25ul；将稀释好的病毒液从低浓度到高浓度加入23ul,放置30min,使充分反应；(2)效价冋滴试验(在最后一列做)：先将稀释好的病毒液取lOOul加入A排；再取50ul生理盐水滴加入B-H排；从A排中取50ul做倍比稀释;(3)加入1%人O型红细胞50ul各孔，放置lh观察结果；先观察效价回滴，看稀释好的病毒液是否在1：8间，如在试验可用，不在试验无效。判断：记录各血清抗体，抑制效价的最大稀释度，最大稀释度效价结果可判断该病毒的血清型。(8)细胞换液先将细胞瓶屮细胞液倒去

7、；加入适量MEM清洗，倒去；配制生长液加入，放置培养箱即可。(9)细胞保存先将细胞瓶屮细胞液倒去；加入MEM清洗，倒去；后加入EDTA■肺酶，清洗一次，倒去；再加入EDTA-胰酶，放入培养，消化后；吸干细胞瓶屮液体，放入培养，待其消化好，取出。配制保存液：小牛血清：二甲基亚砚=9:1吸干细胞瓶屮液体，取1ml保存液吸洗细胞瓶;待其细胞充分混入保存液；吸入保存瓶，拧紧，用封口条封好；放入4°C冰箱2h；取出放入・25°C冰箱2h取岀；放入-70-80°C冰箱保存。