MDCK细胞培养技术.doc

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1、孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,24孔板底面积2cm2,一般加培养液的量1ml,在接种病毒的时候一般病毒用量为添加培养液的5%-20%。在做咽拭子标本时应视标本的采集质量而定，如果标本采集质量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果标本采集的不够好，则应相对加大标本接种量，可以加到1ml.附件1：EDTA处理胰酶　GIBCOBRLCat.#15400HEPES缓冲液1M母液

2、GIBCOBRLCat.#15630-080D-MEM培养基　GIBCOBRLCat.#11965-092青、链霉素母液10,000U/mlGIBCOBRLCat.#15140-122/100ml牛血清白蛋白组分V7.5%溶液GIBCOBRLCat.#5260-037/100ml三、MDCK细胞培养技术（一）生物安全级别和生物安全规定1.MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。2.MDCK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。（二）MDCK细胞的传代培养步骤211.细胞

3、培养所需的材料（部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择）：（1）生长成片的MDCK细胞；（2）T-75细胞培养瓶,颈口有倾角；（3）D-MEM培养液；（4）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000µg/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20℃；（5）HEPES缓冲液，1M母液；（6）胎牛血清；（7）EDTA-胰酶(0.05％胰酶；0.53mMEDTA·4Na)（GibcoCatNo.25300-062），分装后保存于-20℃；（8）牛血清白蛋白组分V，7.5％溶液（GIBCOCatNo.15260）；（9）1mL

4、和10mL无菌移液管等；（10）70％～75％的酒精。建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。2.培养基和试剂的准备:（1）500mL的D-MEM液中加入a)青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)；b)HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)；c)7.5％牛血清白蛋白组分V12.5mL。d)加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)21（1）细胞生长液10mL胎牛血清加到90mL的上述D-MEM液，使胎牛血清的终浓度为10％。每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试

5、确定血清的最佳使用浓度。此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。3.MDCK细胞的传代培养程序此处以T-75细胞瓶单层培养为例，进行叙述。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA－胰酶等，置37℃预热后，用70％～75％酒精擦拭后放于生物安全柜内。（1）弃去细胞已生长成片的细胞培养瓶中的培养液，加5mL37℃预热的EDTA-胰酶；（2）温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶；（3）重新加入5mL37℃预热的EDTA-胰酶，重复上述

6、步骤；（4）加1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从细胞瓶的塑料表面分离（约5min～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入1mL胎牛血清中和残余胰酶的活性；（5）加9mL细胞生长液，轻轻移动移液管吹散细胞团，吹打从培养瓶底部一边开始到另一边结束，确保所有底部均被吹打到，吹打时动作要轻柔，尽量避免出现泡沫；（6）吹打后，瓶中加入90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度约为每mL含105细胞），该培养液含终浓度为10％的胎牛血清；21（1）每个T-25细胞培养瓶中加6mL(6×105/mL细胞)细胞

7、悬液，剩余的细胞悬液可以加到另一T-75细胞瓶以用于细胞传代的种子。通常6mL细胞悬液2～3日可长成80%～90%的单层细胞片；（2）于37℃5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。注：细胞传代的比例可根据细胞生长状况和实验需要进行调节。消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25％胰酶与Versene按照1:7的比例配成消化液使用。（三）细胞的冻存1.细胞冻存材料（1）成片的MDCK细胞：80％～90％成片，细胞生长良好存活率高；（2）二甲基亚砜（DMSO）；（3）胎牛血清；（4）EDTA-胰酶(0.05％胰酶；0.53mMEDTA

8、·4Na)；（5）无菌移液管：1mL和10mL。（6）15mL无菌离心管2.细胞冻存步骤（1）冻存液的制备：胎牛血清9mL；二甲基亚砜1mL。（2）细胞消化：消化过程同细胞培养的消化过程。（3