关于细胞培养技术.doc

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1、细胞培养技术大全一原创一、准备工作准备丁作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的巫视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备丁作的内容包括器1111的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消痔，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代

2、培养。理论上讲各种动物和人体内的所冇组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化髙的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4°C的培养液中保存。取纽织时应严格保持无菌，同时也要避免接触英他的冇害物质。取病理纽.织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。山组织并分离分散细胞的方法可参阅冇关文献。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，

3、则直接将组织块接入培养器皿底部，儿个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养苹。如系细胞培养，一般应在接入培养器1U1Z前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每亳升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（山酚红指示剂指示），此外对培养温度和C6浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，

4、但可贴變和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化怂浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传儿I•代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代卜去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的走好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一•般用液氮的温度一一196°C,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚靦

5、或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间儿乎是无限的。复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后，立即放入37°C水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。一、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或

6、发生转化获得不死性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基木结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。虽然体外细胞与机体细胞存冇差异，但并未失去研究的意义。且不论其仃许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto—genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭/开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰

7、恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的伙1素作用下可以合成血红蛋片，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅

8、大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央冇卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡山中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈不型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央冇圆形核，