细胞培养知识.doc

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1、细胞培养知识细胞培养知识(一)1冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37°C水槽屮快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注童安全，预防冷冻管Z爆裂。2细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO?除少数特别注明对DMSO敏感Z细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻Z后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶屮，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。3可否使用与原先培养条

2、件不同Z培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供Z培养条件不同Z培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4可否使用与原先培养条件不同Z血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的煤响。来白不同物种的血清，在一些物质或分了的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5何谓FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思,两者都是指胎牛血清，FC

3、S乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清。HS(horseserum)贝！］是指马血清。6培养细胞时应使用5%或10%C02?或根本没有影响？一般培养基屮大都使用HC03-/C032-/II+作为pll的缓冲系统，而培养基屮NaIIC03的含量将决定细胞培养时应使用的C02浓度。当培养基屮NaHC03含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%C02；当培养基屮NaHC03为每公升1.5g时，则应使用5%C02培养细胞。7何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基木数据上之更换时间，按时更

4、换培养基即可。8培养基屮是否须添加抗生索？除于特殊筛选系统屮外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。9附着性细胞继代时所使用Ztrypsin-EDTA浓度？应如何处理？一般使用Ztrypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na0第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管屮，保存于-20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsinZ活性降低，并可减少污染之机会。10悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶屮，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，右•到无

5、法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞Z培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。11欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲冋收动物细胞，其离心速率一般为300xg(约l,000rpm),5-10分钟，过高Z转速，将造成细胞死亡。12细胞Z接种密度为何？依照细胞株基木数据上Z接种密度或稀釋分盘Z比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。13细胞冷冻培养基Z成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMS0(dimethylsulfoxide)和9

6、0-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合Z。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO肓接加入细胞液屮，必须使用前先行配制完成。14DMS0之等级和无菌过滤Z方式为何？冷冻保存使用之.DMS0等级，必须为TissueculturegradeDMSO(如SigmaD2650),其木身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4。C,避免反复冷冻解冻造成DMSOZ裂解而释出有害物质，并可减少污染Z机会。若要过滤D.MSO,则须使用耐DMSOZNylon材质滤膜。15冷冻保存细胞Z方法？冷冻保存方法一:冷

7、冻管置于4°C30~60分钟〜(-20°C30分钟*)->-80°C16~18小时(或隔夜)一液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机屮毎分钟降1-3°C至-80°C以下，再放入液氮槽vaporphase长期储存。*-20°C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80。C冰箱屮，惟存活率稍微降低一些。16细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial,融合瘤细胞则以5x106cells/mlvia

8、l为宜。17应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染Z血清和污染Z细胞等。严格Z无菌操作技术、清洁的坏境、与品质良好Z细胞来源和培养