细胞培养必备知识

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1、细胞培养技术Tissueculture1细胞培养cellculture是从体内取出组织的单个细胞或单一细胞群模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并保持细胞特性，为细胞培养。2各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作。由于工作环节多，为保证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应将所有操作程序制定统一规范，在一定时间

2、内保持相对稳定和人人遵守。实验室管理制度3培养用品要有固定的存放地点（培养用品与非培养用品存放分开；已消毒与未消毒品严格分开存放），目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。4二、细胞生存条件及代谢5无污染环境培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。（一）基本条件6适宜温度人体细胞的适宜温度为36.5℃+0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至

3、死亡。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。温度不低于0时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；对培养液中加一定量的保护剂（甘油或二甲基亚砜），封入安瓿中，冻存于液氮中，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞生物性状不受任何影响，成为保存细胞最主要的手段。温度对细胞生长的影响7气体和pH值O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般要把细胞置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中。CO2既是细胞代谢产物

4、，也是细胞所需成分，主要作用在于能维持培养基的pH值。大多数细胞要求7.2-7.4。CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-8营养物质糖、无机盐氨基酸、维生素促细胞生长因子牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源渗透压离子强度：260-320mOsm/Kg人工培养基9二、实验设备无菌间、超净台、洗刷间、储存室、实验工作室孵箱、CO2孵箱、显微镜、纯水器、液氮罐、抽滤装置、离心机、干烤箱、高压灭菌器、加样器培养器皿、耗材（试管、吸管）10三、在肿瘤学中的应用11肿瘤细胞生物特性学研究比较肿

5、瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改变，对于建立诊断标准有益。肿瘤细胞体外生长形态学研究肿瘤细胞生长特性细胞接触抑制实验12肿瘤发病机制研究肿瘤产生诱发因素的研究肿瘤细胞侵润机制和过程的研究肿瘤与正常细胞共同培养法研究肿瘤药物筛选13异种移植研究裸鼠发现与应用建立了动物移植瘤模型抗肿瘤药物筛选研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化又成为新热点14生物治疗活细胞---体细胞---体内活化细胞（LAK）---患者组织---悬液---培养---回输机体15细胞培养：

6、一、原代培养二、传代培养16一原代培养17原代培养（primaryculture）从体内取出组织或细胞的第一次培养18原理  将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA乙二胺四乙酸）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。19仪器、材料及试剂  仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）  材料：动物组织

7、块  试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒20初代消化培养法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入

8、三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。215.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调