细胞培养综合知识.doc

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1、实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸甘激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21(babyhamsterkidney)细胞3、0.25%胰酶

2、4、生长液:含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液(PRV)1)细胞密度:2-3X105个/ml2)pH范围最适pH7.0-7.4,耐受pH6.6-7.83)培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-30°C五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的竣基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发牛水解,导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。3、灰色链丝菌酶：

3、由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和竣肽酶的混合物。六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维牛素、辅酶、瞟吟、囉喘、辅助牛长因子。2、血清1）血清的种类胎牛血清、新牛犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其屮以新牛犊牛血清使用最为广泛。2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。用前56°C灭活30mino3）血清的作用A、能提供细胞牛存、牛长和增牛所必须的牛长调节因子。B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的牛长基质成分。D、有屮和毒性物质保

4、护细胞不受伤害的作用。E、给培养液提供良好的缓冲系统。F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。4）应用血清存在的问题A、血清屮存在不少有害于细胞牛长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、牛长抑制因子。B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。七、传代细胞系培养1、优点：1）可以无限的传代。2）不少细胞系对病毒很敏感。3）某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量牛产。4）牛长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。2、缺丿兄在传代过程屮遭到支原体和病毒的污染。

5、3＞培养方法1）取长满单层的细胞一-瓶，倾去培养液。2）加入2ml胰酶消化液，于37°C培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。3）加入牛长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶屮。再在每个小瓶屮补充牛长液至10ml,然后置37°C培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。八、病毒(PRV)在传代细胞中的培养1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。2、加入适量的病毒悬液3、置温箱中感作(吸附)45min-lho4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱屮继续培养，直至80%以上的细胞病变。5、收毒：将病变

6、的细胞置于-20°C冰箱小，冻结后取出自然解冻，在解冻过程屮振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。实验四病毒感染力的滴定(TCID。的测定)一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCIDso的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量LDso(50%lethaldose):用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EIDso(egg50%infectivedose):用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCIDso(50%tissuecultureinfect

7、ivedose):用细胞来检测蚀斑形成单位(plaqueformingunit,PFU)：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、牛长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液(PRV)四、TCID5。的操作步翡1、在青霉素瓶或离心管屮将病毒液作连续10倍的稀释，从10「10,0o2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板屮，每一-稀释度接种一纵排共8孔,每孔接种100(11。3、在每孔加入细胞悬液100pl,使细胞量达到2^3X105个/ml。4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。(100(11牛长液+100p

8、l细胞悬液)5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCIDso的计算方法1、