细胞培养(入门 基础 升级)综合篇.doc

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1、细胞培养从头学一、常用设备1.准备室的设备：单蒸憾水蒸憾器、双蒸憾水蒸憾器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。2.培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（・80°C）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。3.必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4°C冰箱（放置serum和培养用液）。二

2、、无菌操作（一）无菌室的灭菌：1•定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3%。来苏尔或新洁尔灭或0.5%过氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3%。新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸，再用紫外灯照射。3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20・30分钟。4.实验后灭菌：用75%酒精（3%。新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。（二）实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。3•用75%酒精棉球擦净双手。（三）无菌操作的演示：1•凡是带入超净

3、工作台内的酒精、PBS、培养基、膜蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。2•靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌。4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6•吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。三、器械的清洗和消毒（―）玻璃器械洗消：新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、币巾等物。3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤

4、箱烘干。4.泡酸、清洗：用清洁液（重常酸钾!20g：浓硫酸200ml：蒸憾水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自來水冲洗15次，最后蒸憾水冲洗3・5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消壽：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时,维持20・30分钟。7.高压消毒后烘干旧的玻璃器皿的洗消：1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁

5、液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸憾水冲洗3次。3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取岀用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20・30分钟即可」（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。（二）金属器械洗消：金屈器皿不能泡

6、酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75%酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸他水冲洗，再烘干或空气中晾干。

7、放入铝制盒内包装好在高压锅

8、内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。（三）橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸憾水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1.针式滤器帽不能泡酸液，用NaOH泡6・12小时，或者煮沸20分钟，在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将

9、螺旋旋紧。2.胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸憾水，三蒸水洗净，烘干。韩装入铝盒内高压消毒，烘干备用。1.胶帽，离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6・12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸憾水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。2.胶头可用75%酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。3.塑料培养瓶，培养板，冻存管：4.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，乂不能蒸气消毒，