细胞培养入门技术.ppt

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1、细胞培养基本技术目的：了解哺乳动物细胞培养的一般步骤，学习细胞培养基本技术原理：无菌操作细胞休眠离心机橱柜实验台冰箱培养箱试剂柜实验仪器台超净工作台实验台实验台实验台实验台水池冰箱衣柜实验台显微镜递物窗缓冲间无菌操作室准备室1.细胞培养室设置细胞培养前的实验准备下风口上风口无菌操作室超净工作台和CO2培养箱2.细胞培养的主要实验设备超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2使用CO2培养箱

2、培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒③箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。解剖显微镜倒置显微镜2.细胞培养的主要实验设备血清（天然成分）：基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM、α-MEM、RPMI1640水：高纯度的去离子水细胞培养的主要试剂（培养基）抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/ml血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优

3、质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌血清的使用浓度为5％～20％消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁，用含血清培养液中止其活性细胞培养用器皿的清洗和消毒一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），15磅，15～20min2、过滤除菌(如：血清的

4、除菌）细胞培养(cellculture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。细胞培养（CellCulture）细胞培养的基本概念原代培养(primaryculture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。原代培养（PrimaryCulture）细胞培养的基本概念传代培养（SecondlyCulture）传代培养(secondl

5、yculture)，在原代培养物铺展为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。细胞培养的基本概念细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫培养细胞的类型贴附型成纤维样细胞型上皮样细胞型悬浮型细胞培养的基本概念培养人真皮成纤维细胞培养人口腔上皮细胞培养的骨髓瘤细胞贴附型细胞的生长特性细胞的贴壁生长接触抑制细胞的生长曲线细胞贴壁延展过程(模式图)细胞培养的基本概念细胞的接触抑制现象正常培养细胞的生长曲线退化

6、死亡平台期细胞数增大极限点，出现接触抑制细胞指数生长极限点指数生长期潜伏期细胞数量024487296120小时指数生长期是最佳实验期!培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨

7、酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实

8、验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质