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1、應用細胞培養技術分離結核分枝桿菌林敬覆 楊喜金 黎南榮 蕭終融 吳義興 張惟茗 陳素貞 蘇杰夫行政院農委會家畜衛生試驗所摘 要將本所分離所得之牛型結核分枝桿菌(M.bovis-YL)株分別接種於初代豬肺臟大吞噬細胞(Swinealvoelarmacrophage,SAM)及株化細胞OCC和Marc-145,並於接種後第1,2,3,4,5,6,及7天分別固定﹑染色與鏡檢﹐結果顯示於接種第3天以後，上述三種細胞培養，經檢測結果，均可見到明顯的結核分枝桿菌增殖。將PPD皮內注射測定，判定為陽性反應牛隻之淋巴﹑臟器組織乳劑分別以斜面培養基（L
2、owenstein-Jensenmedium，L-JM）及上述組織培養進行結核分枝桿菌分離，結果顯示以上述組織培養分離者只需於接種後7及14天，便可以抗酸菌染色方法染色後鏡檢，即可判定有無結核分枝桿菌增殖。而以Slant分離者，則需經5～14週菌落形成後，才可進行釣菌、固定、染色後鏡檢。至於其分離率經分析結果組織培養及斜面培養基培養分離牛病材並無差異，均為43.46％(33/76)。關鍵詞：牛型結核分枝桿菌關鍵詞：牛型結核分枝桿菌、初代豬肺臟大吞噬細胞：牛型結核分枝桿菌、初代豬肺臟大吞噬細胞、斜面、初代豬肺臟大吞噬細胞、斜面培養基、斜面
3、培養基緒 言由於以傳統之斜面培養基（Lowenstein-Jensenmedium，L-JM）分離結核分枝桿菌至少需時5至14週(1,6)，為縮短其分離時間，以提升診斷品質及時效，而自行研發改良以組織培養分離本菌(2,3,4,5,7,8,9,10,11,12)，以與斜面培養基分別分離本菌之結果分析比較，以供參考。今就所使用之方法、材料及結果等，分述於下。材料與方法首將本所分離所得之牛型結核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)分離株(M.bovis-YL)分別接種於初代豬肺臟大吞噬細胞(Swinealvoel
4、armacrophage,SAM)及株化細胞OCC和Marc-145,並於接種後後第1天起每天各取3片Chamberslide固定、抗酸菌染色、鏡檢至第7天。次將以PPD皮內注射測定，判定為陽性反應牛隻、鹿及羊之臟器淋巴組織，分別以0.1％之次氯酸納溶液清洗後，浸置於4℃下12～24小時，取出後以無菌剪刀細剪後，加入適量(3～5mL)35-2-1之Dubos’broth後，以電動磨碎機(Grinder)磨碎後，加入0.5N之NaOH處理30分鐘後，再加入6N之HCl處理30分鐘，最後以1N之NaOH加入中和處理30分鐘後，放入具有冷卻裝
5、置之離心機以3,000rpm離心30分鐘後，倒棄上清液，將其沉澱物分別接種培養於Chamberslide內之SAM及Marc-145、OCC株化細胞和不含甘油之L-J(w/o)M及含2﹪Tween80之L-J(t80)M卵培地之Slant斜面培養基試管後，分別放置內含5％CO2，37℃之恆溫箱內培養，接種於上述組織培養者，如同上述於接種後第1天起，每天分別各取3片Chamberslide固定、抗酸菌染色、鏡檢至第7天。在斜面培養基培養方面則需5～14週菌落形成後，再行釣菌、固定，抗酸菌染色後鏡檢。以Slant斜面培養基分離與接種於組織培
6、養者之分離結果進行比較，以供分析、評估時之資料。結 果將牛型結核分枝桿菌分離株(M.bovis-YL)分別接種於SAM，Marc-145及OCC組織培養後，經7天之檢測結果發現，於接種後第3天可見其明顯增殖(如圖1)。至於分別接種Marc-145組織培養及Slant斜面培養基之PPD測定呈陽性反應牛試材，其接種於組織培養者，經測試發現於第一次接種後7及第二次接種後7天(前後14天)結果與接種在Slant5～14週菌落形成後，檢測比較其分離率，結果一致均為43.46％(33/76)(如表1)。圖1.M.bovis-YL株接種在Marc-
7、145細胞後第3天之增殖情形35-2-2表1﹒M.bovis-YL及PPD皮內注射測定，判定為陽性反應牛隻(有病灶及無病灶)之臟器淋巴組織乳劑分別接種於Slant﹐SAM﹐Marc-145﹐OCC等細胞﹒小計(分離菌株數/測試頭數)縣市測試頭數SlantTissueculture備註欄L-J(w/o)ML-J(t80)MSMAMarc-145OCC細胞陰性對照2－－－－－本菌(M.bovis-2＋＋＋＋＋YL)陽性對照彰 化 縣1812/1812/1812/18嘉 義 縣100/100/100/10臺 南 縣207/207/207/20
8、臺 南 市30/30/30/3高雄縣20/20/20/2屏東縣2314/2314/2314/23合計7633/7633/7633/76百 分 比43.46%43.46%43.46%表2.M.Bovis-YL
