细胞培养技术讲座(2)

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1、研究生实验技术系列讲座(一)细胞培养技术（二）CellCulture季明春2008-11-30细胞培养技术CellCulture•一、细胞培养基本条件•二、细胞培养无菌操作基本技术•三、培养细胞的生物学特征二、细胞培养无菌操作基本技术•1、工作环境及表面的处理•2、细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理•3、培养液与培养细胞的处理（一）无菌操作技术•体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，为在一切操作中最大可

2、能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。1、培养前准备•在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。1、培养前准备•工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣后才进行实验。•对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO及TP

3、A等，并避免尖锐物品伤人等。2、操作野消毒•无菌培养室定期要用1‰新洁尔灭拖洗地面(拖布要专用)。必要时每周用10％乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟。•实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌，用1‰新洁尔灭（或75%酒精）擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始实验操作。•每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。2、操作野消毒•在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降

4、低消毒效果。•—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用1‰新洁尔灭擦洗后置于台内同时紫外线消毒。3、洗手和着装•原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。•在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。•如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。•做原代培养需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。4、火焰消毒•在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切

5、操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。•培养瓶•滴管、试管、吸管•接种环、接种针5、实验操作•无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品（如试管架、移液器或吸管头等）可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用1‰新洁尔灭（或75%酒精擦）拭后才能带入无菌操作台内。•实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。5、实验操作•小心取出无菌实验用品，避免造成污染。•切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用

6、手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。5、实验操作•进行培养细胞操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。•不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。6、工作环境的处理•定期检查下列项目：•CO钢瓶内的CO压力；22•CO培养箱内的CO浓度、温度，以及及水22盘是否有污染；•无菌操作台内气流压力是否正常；•定期更换紫外灯管；•定期更换洗手液；三、培养细胞的生物学特征Hepatocytes（一）体外培养细胞的分型•1、贴附型•2、悬浮

7、型（一）体外培养细胞的分型1、贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：（1）成纤维细胞型（2）上皮型细胞（3）游走细胞型（4）多型细胞型（1）成纤维细胞型：（1）成纤维细胞型：名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的细胞来源：由中胚层间充质组织起源的组织，如：真正的成纤维细胞，心肌细胞，平滑肌细胞，成骨细胞，血管内皮细胞形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩

8、涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起（2）上皮型细胞：上皮型细胞（2）上皮型细胞：名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，圆形核生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长