细胞培养技术讲座(3).pdf

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1、研究生实验技术系列讲座(一)细胞培养的相关问题CellCulture（3）季明春2008-11-301、如何选择细胞培养基？•有几点建议可供参考：•(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。•(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。•(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640。•(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。1、如何选用细胞

2、培养基？•培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总的，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。2、培养基保存于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性。怎么办？•培养基保存于4°C冰箱中，培养基内的CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。•培养基偏碱的结果，将造成细胞生长停滞或死亡。•若培养基偏碱时，可以在使用前松开瓶口，在CO培养箱2孵育培养基10-15分钟，来校正溶

3、液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。3、为什么培养基中可以省去加酚红？•酚红在培养基中用作pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。•研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。4、培养基中是否必须添加抗生素？•除于在特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。5、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？•丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳

4、源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。6、何谓FBS,FCS,CS,HS?•FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清。•CS(calfserum)则是指小牛血清。•HS(horseserum)则是指马血清。7、培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？•一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。8、保存血清最好的方法?•建议血清应保存在-4℃至-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无

5、法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。9、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?•血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白的一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。•若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心上清液即可。•最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。10、有必要做血清热灭活吗?•实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。

6、经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。•若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!11、如何避免血清沉淀物的产生?•建议在使用血清的时候，注意下列的操作:(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的

7、温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时，请随时将的摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。12、CO培养箱的水盘如何保持清洁？2•1、定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换。•2、硫酸

8、铜溶液。13、培养细胞时应使用5%或1