资源描述：
《细胞培养学笔记(3)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、细胞培养学笔记（3）一、正常细胞培养1.上皮细胞类培养:来源于外、内、中三个胚层。上皮细胞培养有三个难点:①需求特殊底物,如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长;②需求特殊培养基;③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长,并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。a.表皮细胞培养:(1)取材:切成0.5-1cm2小块;(2)EDTA处理:室温置5分钟;(3)冷消化:换入胰蛋白酶中,置4℃过夜;(4)分离:取出皮块表皮与真皮层分开;(5)温消化:表皮剪成更小的块后,置入新的胰蛋白酶中,37℃再消化30-60分钟;(6)用吸管轻轻
2、反复吹打,使成细胞悬液;(7)培养液:过滤,离心,吸上清,直接加入Eagle液和血清,制成细胞悬液,接种入培养瓶中培养。b.乳腺组织培养:(1)直接培养法:适于培养含纤维少的软组织,在含有少量培养液的容器中,将组织切割成碎块,注入离心管中,补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架中3-5min。吸除上层液可排除非腺细胞成分,重复2-3次,末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,立即滤入另管中,调整密度,接种入培养瓶中培养。(2)胶原酶消化法:适于处理含纤维多的较硬组织,其过程与培养其它组织相同。c.胃上皮细胞培养:(1)取材:取远端非病变区粘膜少许
3、;(2)清洗:含庆大霉素和二性霉素的Hanks液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成lmm3大小;(3)消化:在I型胶原酶和透明质酸酶中,37℃消化80min;(4)离心:收集细胞悬液,离心,Hanks液漂洗两次;(5)接种:接种入培养板中;在16小时内贴壁,细胞呈多角形,岛状或片状生长,以后逐渐联接成片。初代培养可维持2-3周,第一周末达高峰,最后逐渐衰退剥落。d.肝细胞培养：初代组织块培养:取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,剪成1mm3左右的小块,采用贴壁培养法。一般次日即可出现生长晕。初代消化法培养:(1)把肝组织切成2-4mm3的小块,用不含钙镁的BSS
4、液洗两次;(2)移入1:1胰蛋白酶和胶原酶中,4℃冷消化10-12h后,过滤;(3)收集细胞:BSS液洗、计数、接种培养;灌流法:(1)无菌解剖动物,取出肝脏,BSS洗;(2)吸取消化液后,把注射器头插入肝管中,结扎牢固,以防漏出,注入胆管系统,使消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20-30分后,吸出消化液的同时并轻柔压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出;(3)待吸净消化液后,注入离心管中,离心,用RPMI1640培养基培养,能获得较纯的肝上皮细胞。传代培养:待细胞生长连接成片后,用BSS洗,加1:1的0.025%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化3-5min
5、,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液,用BSS洗,接种培养。e.内皮细胞培养:灌流消化法:(1)取新鲜脐带,可保存于4℃中,但不宜超过12小时,无菌剪取长10-15cm;(2)先用三通注射器吸温PBS注入脐静脉中,洗除残血,注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流;(3)用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉注入终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后结扎,注入口亦应结扎,以防液体返流,消化3-10min;(4)吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,可再冲洗2-3次,一并注入离心管中离心;(5)接种入培养瓶中培养,顺利时2-3天内细胞即可长成单层。f.毛细血管内皮细
6、胞初代培养:(1)取材:取牛肾上腺数个,用Hanks除血污;(2)除被膜,分离皮质,切成1mm3小块,加0.5%胶原酶室温消化1h;每隔10min吹打令消化充分;(3)过滤,网眼只允许通过小于110µm的毛细血管小段;(4)离心,弃上清,共两次;末次用Eagle氏培养液重悬;(5)接种入铺有明胶底层的培养皿中,37℃培养;前1-3h,毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮;(6)吸除培养液,加入条件培养液;每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1-4个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2-5天
7、。毛细血管内皮细胞分离培养:(1)初代培养2-3天后,在培养皿背面,圈记毛细血管内皮细胞岛;(2)如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在镜下挑除,时间不宜过长;圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除;(3)用培养液漂洗,以去除漂浮细胞;(4)剩余内皮细胞岛如少时,生长增殖常变得缓慢,此时需加入饲细胞;(5)当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、加入条件培养基;(6)接种入明胶底物皿中继续培养,细胞增殖生长汇合后,传代。2.结缔组织细胞培养a.成纤维细胞培养:用人或动物胚体为好。动物可用小鼠或鸡胚,去头和内脏,剪成小碎块后。用胰蛋白酶消化法培养;如为人胚,
8、可取皮肤培养。幼儿包皮是
