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1、细胞培养学笔记（4）一、细胞一般形态学观察法1.细胞固定方法:(1)甲醇/醋酸(3:1):甲醇穿透力好易于挥发;醋酸固定蛋白效果好,可使细胞膨胀,结合使用,能维持细胞形态不变,用于观察染色体.(2)FAA固定液:(80%酒精90ml;冰醋酸5m1;中性福尔马林(用时向瓶中加过量MgCO3中和)5ml.)用于盖片单层培养.(3)Carnoy(纯酒精60ml;氯仿30ml;冰醋酸10ml):是非水溶性固定液,穿透力差,适用于显示细胞化学成分等方法,对固定培养单层细胞效果非常好.2.一般染色法:Giemsa染色法:(1)Giemsa粉0
2、.5g,甘油22ml研磨;(2)56℃保温2小时后,加入33ml纯甲醉,保存;(3)pH6.8-7.38的磷酸盐缓冲液,按1:9比例稀释染液;(4)甲醇固定10min,或醋酸/甲醇固定30min,染色;(5)染10-15min,自来水冲,干燥,二甲苯透化,树脂胶封.胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色.苏木精-伊红染色法:(1)37℃温BSS洗3次,20s-1min,中性福尔马林固定3min;(2)蒸馏水洗1次,再用稀释的苏木精液(1/20)染10min;(3)水洗,置入1%NaHCO3液中漂洗至蓝紫色;(4)伊红水溶液中染30
3、s-1min;(5)蒸馏水洗,迅速通过丙酮2次,每次3-5min;(6)通过2:1丙酮/二甲苯3次,每次1-2min;(7)通过1:2丙酮/二甲苯3次.每次1-2min;(8)纯二甲苯5-10min;(9)把盖片置载物玻片上,用树胶封存,再覆以较大盖片.Feulgen染色法:鉴别细胞中DNA的组织化学方法.细胞中的DNA在60℃,用1MHC1酸解离脱氧核糖核酸,使嘌呤碱基与糖苷键破坏,嘌呤碱脱掉,脱氧核糖中的醛基游离;醛基能与Schiff试剂相结合,形成一种紫色的复合物.(1)单层盖片法培养细胞,Carnoy或醋酸/甲醇固定20-
4、30min;(2)室温投入1MHC11-2min(3)60℃投入1MHCl8-10min;(4)10℃暗处投入Schiff剂中染色1-5h;(5)漂洗液洗2x2min;(6)蒸馏水漂洗2x2min;(7)酒精75%-100%脱水;(8)透化:二甲苯2次,每次3min;(9)盖片置于载物片上,滴少许树胶,再加较大盖片覆盖;(10)盖片加微型重物加压数日,树胶干后观察.镜下可见,细胞核成粉红色至紫红色,胞质无色.吖啶橙染色荧光观察法:(1)盖片培养细胞,温Hanks洗3-5s;(2)投入95%酒精或醋酸/甲醇min;(3)1%醋酸作用
5、30s;(4)1×10-4吖啶橙染30s或1min;(5)0.1MCaCl2处理30s-2min;(6)PBS漂洗3次,每次数秒;(7)PBS封片,荧光显微镜下直接观察并拍照.3.透射电子显微镜:常用超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻复型法超薄切片法:取材;固定(戊二醛2.5%-5%;锇酸1%;高锰酸钾;甲醛、多聚甲醛);脱水二、免疫细胞化学技术观察细胞成分法1.原理:用荧光素或酶等标记物或显色物标记特异性抗体,通过免疫学反应与细胞内的相应抗原结合,形成带有荧光素或显色物的抗原抗体复合物.可用荧光显微镜或普通光学显微镜观察到复合物,
6、达到检测细胞内抗原物质的目的.细胞免疫化学包括标本的准备(制备、储存、固定)、染色方法以及结果的分析判断,非特异性染色的减轻、消除等.2.标本制备及固定:细胞可直接培养在盖玻片上、培养瓶内或培养板上,也可将一定量的细胞收集离心制成涂片.福尔马林类1-15min;丙酮类5-15min;4%多聚甲醛类3-5min注意事项:①立即固定,防止细胞自溶,保持其固有的组织结构,保存细胞内的抗原性,使抗原不失活,不发生弥散和保证免疫组化定位准确.彻底清洗多余的固定液,否则将影响免疫组化染色效果.②以室温为宜,某些酶的固定,要求在37℃下进行.3
7、.染色方法(1)免疫荧光技术:直接法:以荧光素标记的抗体直接与标本内的抗原反应,形成抗原-荧光素标记抗体复合物.(1)固定,PBS洗3×3min;(2)荧光素标记的抗体,湿盒内37℃孵育50min,PBS洗;(3)0.1%伊文氏兰复染,PBS洗3×3min,去NaCl结晶;(4)甘油封片,镜检.间接法:特异性抗体与细胞内相应抗原结合,再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合,形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物.(1)固定,PBS洗涤3×3min;(2)滴加一抗,37℃40min或4℃过夜,PBS洗3×3min;(3)滴加荧光
8、标记二抗37℃40minPBS洗3×3min;(4)0.1%伊文氏兰复染;PBS洗3×3min;(5)甘油封片,镜检.(2)标本保存及封片介质的制备:如需保存,可在0-5℃暗处保存.用缓冲甘油封固的标本,过夜后特异荧光褪色约25%,一周后褪色约60
