禽流感病毒NP基因的真核表达及抗体检测芯片的建立.pdf

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1、第33卷第5期中国预防兽医学报VO1．33．NO．52011年5月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineMay．2011doi：10．3969／j．issn．1008—0589．2011．05．07禽流感病毒NP基因的真核表达及抗体检测芯片的建立赵玉辉，王馥梅，包红梅，孙晓东，路冰，熊永忠，陈化兰，王秀荣(1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室／兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001；2．浙江普洛医药科技有限公司，浙江杭州310000)摘要：为建立一种检

2、测A型禽流感病毒(AIv1抗体的蛋白芯片，本研究以AIV总RNA为模板，RT—PCR方法扩增NP基因，与真核表达栽体pFastBacHTa连接，并在昆虫细胞中表达。重组蛋白经纯化及westernblot鉴定，点样于醛基包被的载玻片上，制备检测AIV抗体的蛋白芯片。确定芯片反应最佳条件为：点样浓度2mg／mL，固定24h，1％BSA进行封闭，一抗稀释度1：100，二抗稀释度1：2000。利用蛋白芯片分别对15个亚型流感病毒免疫血清、SPF鸡血清、抗新城疫病毒血清、抗法氏囊病毒血清和现地血清样品进行检测，通过与血凝抑制试验比较，表明建立

3、的蛋白芯片方法具有良好的灵敏性和特异性，为AIV抗体检测及制备检测AIV不同亚型或多种病原抗体的蛋白芯片提供方法。关键词：流感病毒；NP蛋白；真核表达；蛋白芯片中图分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：1008．0589(2011105—0362—04PreparationofproteinmicroarrayanalysiswitheukaryoticexpressedNPproteinfordetectionofavianinfluenzavirusantibodyZHAOYu—hui，WANGFu—mei，BAOHon

4、g-mei，SUNxiao-dong，LUBing，XIONGYong—zhong，CHENHua-lan，WANGXiu—rong(1．StateAvianInfluenzaReferenceLaboratoryandStateKeyLaboratoryofVetefinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China；2．ZhejiangApeloaJiayuanPh

5、armaceuticalCo．Ltd，Hangzhou310000，China)Abstract：Thispaperdescribedaproteinmicroarray，whichcouldbeusedintodetectantibodyofinfluenzaAvirus(A1V)usingrecombinantNPprotein．TheNPgenewasamplifiedbyRT—PCRfromviralRNAandclonedintotheeukaryoticexpressionvectorpFastBacHTatoexpre

6、ssrecombinantprotein．Therecombinantproteinwasidentifiedbywesternblot，purifiedthroughNiafinitychromatographyandspottedonthealdehyde—coatedslidestoprepareproteinmicroarray．TheoptimizedconditionsoftheassaywereincludedaspotingNPproteinconcentrationof2mg／mL，immobilitytimeof

7、24h，1％BSAasblockingbufer，1：100serumdilutionand1：2，000dilutionforsecondantibody．ThisassaywasusedtotestonpositiveseraagainstAIVsubtype1to15．newcastlediseasevirus，infectiousbursa1diseasevirus，andchickenclinicserumsamples，comparedwimHItest．Theresultshowedthatthisproteinmic

8、roarraywasspecificandsensitiveforAIVantibodydetection．ThisworkprovidedanovelmethodforAIVantibodydetectionandlaidthefo