基于16S rRNA基因克隆文库技术分析广西富钟水牛瘤胃产甲烷菌组成及多样性.pdf

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1、动物营养学报2014，26(12)：3635—3642ChineseJournalofAnimalNutritiondoi：1O．3969／j．issn．1006-267x．2014．12．012基于16SrRNA基因克隆文库技术分析广西富钟水牛瘤胃产甲烷菌组成及多样性杨承剑梁辛韦升菊李舒露梁贤威邹彩霞杨炳壮李丽莉(中国农业科学院广西水牛研究所，农业部(广西)水牛遗传繁育重点实验室，南宁530001)摘要：本研究旨在利用16SrRNA基因克隆库技术分析广西富钟水牛瘤胃产甲烷菌组成及多样性。选取3头体况基本一致的健康雌性富钟水牛作为试验动物，采用机械破

2、壁法提取瘤胃内容物总DNA，采用产甲烷菌引物Met86F／Metl34OR扩增16SrRNA基因，构建16SrRNA基因克隆文库。结果表明，本试验共获得93个非嵌合体16SrRNA序列，按照97％的相似性划分为39个分类操作单元(OTU)。其中，60个序列(15个OTU)与已培养细菌16SrRNA序列相似性≥97％，占总序列的64．5％；32个序列(23个OTU)与已培养菌16SrRNA序列相似性处于90％～(<97％)；仅有1个序列与Methanomassiliicoccusluminyensis相似性<90％。系统发育树分析表明，98．9％的序列

3、均属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)，部分序列与Methanobacteriales中任何已知相似序列都相隔较远，它们可能代表Methanobacteriales中新的属或种。由上述结果可见，富钟水牛瘤胃产甲烷菌以Methanobacteriales为优势茵群，其中有许多未知的产甲烷菌需进一步分离培养并对其功能进行分析。关键词：富钟水牛；瘤胃；产甲烷菌；多样性中图分类号：S823文献标识码：A文章编号：1006-267X(2014)12—3635—08广西富钟水牛是我国地方水牛的特色品种之物区系不同。产甲烷菌，通常也称为产甲烷古一

4、菌，广泛存在于反刍动物胃肠道中j。在饲料消，2006年被列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》]。富钟水牛体型较大，具有繁殖力高、成熟化利用过程中，产甲烷菌能够利用各种不同底物，早、肉质好、性情温顺、耐粗饲等优良特性，适如氢、甲酸、乙酸、甲醇等，还原二氧化碳进而生成合广西壮族自治区东北丘陵地带以低洼水田及黏甲烷j。反刍动物的甲烷生成意味着大量能量损性土壤旱地的耕作环境条件生长。然而，据2009失。目前已有研究显示，多种动物体内均可分年统计数据显示，富钟水牛的存栏量仅12．1万离出产甲烷菌J。部分研究也利用非培养的方头。深人研究富钟水牛的消化生理以及营养特

5、式，如16SrRNA基因克隆文库分析等方法研究了性有助于其优良种质资源的保护。绵羊、婆罗门杂交牛】、晋南牛_1瘤胃内产甲反刍动物主要依赖瘤胃微生物将结构性碳水烷菌的组成及多样性。更有研究表明，不同肥胖化合物降解为挥发性脂肪酸为机体提供能量。不程度的人或者不同品种的猪肠道中的产甲同种类反刍动物其瘤胃微生物结构组成可能存在烷菌结构也存在差异。这些研究表明，胃肠道中一定差异，有研究表明不同种类的山羊瘤胃微生产甲烷菌多样性可能与物种特异性或与特定功能收稿日期：2014—06—01基金项目：广西自然基金青年基金项目(2Ol2GxNsFBAO53070)；广西水

6、产畜牧兽医局科技计划项目(桂渔牧科1304516)；农业部948项目(2011-G26)作者简介：杨承剑(1981一)，男，湖南江华人，助理研究员，博士，研究方向为动物消化道微生物。E—mail：ycj0746@sina．com}通讯作者：梁贤威，研究员，E—mail：liangbri@126．com动物营养学报26卷紧密相关。作为广西壮族自治区特色遗传资源品试验期30d，第30天晨饲前通过胃管式瘤胃种之一，富钟水牛瘤胃微生物可能具有其独特的液采样器采集瘤胃内容物250mL，装人干净充满微生物区系，但目前尚未见关于富钟水牛瘤胃微二氧化碳厌氧瓶中，置于

7、碎冰块中冷藏迅速带回生物方面的研究。因此，本研究利用16SrRNA基实验室，保存于-80℃冰箱备用。因克隆文库技术分析富钟水牛瘤胃产甲烷菌组成1．2总DNA提取及多样性，为进一步研究富钟水牛瘤胃微生物生从充分混匀后的250mL瘤胃样品中用宽口态系统功能以及品种资源保护提供理论依据。吸头吸取1．5mL包括瘤胃固、液2相的瘤胃内容物用于总DNA的提取，12000~g离心5min，去除1材料与方法上清液，沉淀备用。采用文献[15]所描述的机械1-1试验设计破壁及总DNA提取试剂盒相结合的方法提取总选取3头体况基本一致的5岁左右的健康成DNA。年雌性富钟泌乳

8、水牛，饲养于广西壮族自治区水1．3PCR扩增及克隆文库构建牛研究所水牛场(国家级重点种畜场)。自由采食产甲烷