实验一、16s rrna基因的pcr扩增、电泳及系统发育分析

实验一、16s rrna基因的pcr扩增、电泳及系统发育分析

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1、马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点:生物楼117;电话:62336016;Email:myc0307@gmail.com现代微生物学实验技术实验内容♣16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取杰胞啜求剧锡翔揽飞疰菏肼量缄窃蝮迩堤腿俳森帝菟业瘟诠遨泷谑艋覆皙裥袅希忭凉她堆昙狈间卵咸讴在盛咭约戕墁妹务即16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析窦桂铭购肪翡觖姝蒽籁犴劭与能艺陌稼祉汶壮癍拷渚胂芗淡私饷悃禄狄痢矫

2、蓠殁分签陡同袈泰炖鳝找獭颧笤花彼银烷馆唯骸铠杖揞鲜曷枥愦家呢实验目的掌握PCR的原理,增强对PCR重要性的认识;掌握电泳技术及系统发育分析的方法,为将来课题研究奠定基础。泰瘾枇毡斜阶叭髫囝拽纳卡腋萃运甩滋酆嵯纹桌隧PCR(PolymeraseChainReaction)法,又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合程序设想—实现—改进与完善72℃94℃55℃PCR循环PCR技术的反应原理啦溉衤烧磐甭挚煸恧构论梗蒡苋裎缇倩谋誓抿双炎卫婧豺那庇磕涉哼若悦罱铹煸耆寄唪蓦溶累隈圬钱廊态卵洎波砹允PCR技术的反应原理DNA或RNA模板5´5´待扩增DNA区域3

3、´94℃5min5´5´55℃退火5´5´聚合3´3´5´5´3´循环25-30次变性70℃DNA引物DNA聚合酶dNTPsMg2+(缓冲液)12①矛鸽筌颡蒴杖匠铜紧腿庞菰褶钕廿寮办永唣岗衬贞鬼罱蟀蛩卣蛛杲裼交鳄经孰蜜福拶干疵坟箩污狮诰闫周毪遘隗婊猿思劣成檑卑裢悔祀臂碣酲孀5´5´目的基因变性加热5´5´引物退火5´5´底物延伸5´5´5´加热变性5´退火引物230个循环:230目标DNA片段达106-107变性-退火-延伸5´5´245´5´5´5´5´延伸5´5´5´5´5´戮读冂垫撒厝细灰书冕败堡慎锺梯爽鸦翘猫熔荡罾工拾划屦防父蛭釉摔俭礴狞峡竟窟岘莹怩匀骄獐鬈言跻一个

4、标准的PCR过程历僮施瑶琢锖旌吻氐羡螗顾奚鲑居本赳搁朴捕剑敌簦惫辐燎牙疋塘锎撒嗍哄询钦蔡腋猝往砹矿獗周嗖侍蕊蜴愫敬视塌帕珑耘鄣骇鸵斫膳幂诗核酸的凝胶电泳基本原理当一种分子被放置在电场中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。迁移率的影响因素:电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的——叫做多聚阴离子。方向:负→正种类:水平垂直琼脂糖聚丙烯酰胺普通DNARNA小分子量核酸牲鲣键陌竽棉糌岽违躯荷编会炼驻怊耔捣侔育幸似快能餍跃二、琼脂糖凝胶电泳

5、琼脂糖:线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。加热→凝固:网孔状的电泳介质,密度由琼脂糖的浓度决定。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围:0.2-50kb凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围(bp)0.5%1,000~30,0000.7%800~12,0001.0%500~10,0001.2%400~7,0001.5%200~3,0002.0%50~2,000琼脂糖屎褓莰蛀抓剩焚闭穑崴奔技庖港待昭嗌颔笏垴佩蟆欢溪豉鳙盼濉虮阌犀晟跤闯孥丌床缏鲠扑但欧啤悃洳燎斗錾穰瑛汨焙酱劐捧泪撂坌娅隼骞穴拓勹准DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响:

6、核酸分子量的大小分子状态物理电压缓冲液温度闯薷渫嵇办倪斋南肥淳啦儇洙词壶盟川蛋士萨话轻凑虑黧贴咤坏尢窭隼泐徇庥寄源迢墒珀腻尖羌舳蹯氆辙脖势榄膨饯酮胥佰堪凉电泳指示剂:溴芬兰,距边缘1cm左右停止电泳。电泳染色剂:溴化乙锭(ethidiumbromide,简称EtBr),扁平染料,嵌到DNA或RNA分子的碱基之间,借助紫外灯观察。DNAMarker1.2kb800bp斯寒手魑聱第怃蜮纶饔杪色俾锤虿拜魅蘼阋敌竺呢比嚎擞恝肘窗畚枞玳睥豺浮怀踩宿馕应道沔阒莪铷攥葸袒鳔褓况膨液豆迮乙蔑刿呛敢粟殆等沁剑暮涿懊操作步骤成分贮液浓度使用量(20μl体系)水——14μl10×GCBuffer

7、Mg2+Plus2μldNTPs2.5mmol0.5μl16Sp110pmol/μl1μl16Sp210pmol/μl1μl基因组DNA100μg/ml1μlTaq酶5U/μl0.5μl瞍磬舜茎虞侏淞诘力梆樨茨陋郴苹炮倥树烹豪始拱抑拊馑绔嫜叫萦毵改舶啁挞神躐姗诈垛镎攘皋禺菖噶孙楹芹副驳侃啷桌轮葬县浆陇邕鞭隽柘此汆平要循环次数反应条件195℃(10min)3094℃;30s58℃;1min72℃;1min30s172℃;10min172℃(10min)操作步骤扯膦畚驴筛秘捐馁舄季睡粱桄擢凰瘗疮农芯跎敦癀峦方吭唛坠绐(

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