实验五pcr基因扩增

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1、PCR基因扩增一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术二、实验原理PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，由美国人B.Mullis于1983年发明包括三个基本步骤:变性（Denature）：目的双链DNA片段在94℃下解链退火（Anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为

2、下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍5’3’5’3’DoublestrandedDNAtemplateRegiontobeamplified5’3’5’3’DesignprimerswiththissequenceinformationIdenticaltothissequenceReversecomplementofthissequenceDoublestrandedDNAtemplate5’3’5’3’PCRCycle1PrimersTaqTaqDoublestrandedDNAtemplate5’5’

3、3’3’PCRCycle1Denaturation95℃strandsseparatePrimersTaqTaqTaqpolymeraseisthermostable3’5’5’3’Annealing~55℃PrimersbindTaqTaqForwardprimerannealstolowerstrandReverseprimerannealstoupperstrandPCRCycle13’5’5’3’Annealing~55℃TaqbindsTaqTaqPCRCycle13’5’5’3’Extension72℃TaqcopiesDN

4、AstranddNTPsTaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle13’5’5’3’TaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1Extension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPs3’5’5’3’TaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1Extension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPs3’5’5’3’Taqsynthe

5、sisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1TaqTaqExtension72℃TaqcopiesDNAstranddNTPs3’5’5’3’5’3’5’3’Endcycle1PCRCYCLE13’5’5’3’5’5’3’3’PCRCycle2Denaturation95℃strandsseparate3’5’5’3’5’5’3’3’Annealing~55℃PrimersbindPCRCycle2Extension72℃TaqcopiesDNAstrandPCRCycle2Twosinglestrands

6、ofcorrectlengthPCRCycle2Endcycle2Endcycle3Endcycle4FollowingncyclesofPCRtherewillbeNo(1+Y)ncopiesNoinitialnumberoftargetsYefficiencyofPCRreactionncyclenumber1、PCR反应中的主要成份引物dNTPMg2+模板TaqDNA聚合酶反应缓冲液引物PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则：引物长度约为16～30bp引物中G+C含量通常为40%

7、～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点引物不与模板结合位点以外的序列互补简并引物应选用简并程度低的密码子引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引

8、物浓度偏低则降低产量dNTPdNTP常用的浓度为20～200μmol/，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺