实验1pcr扩增基因

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1、实验一PCR扩增基因【实验目的】通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。【实验原理】•聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是•一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。它包括：变性(Denature)、退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使H的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25〜35轮循环就可使DNA扩增达106倍。•利用PCR技术可

2、在短时间闪获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。•PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。•PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。•Stepl.变性：加热使模板DNA在高温下(94°C)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。•Step2.退火：溶液温度降至50〜60°C,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。•St

3、ep3.延伸：溶液反应温度升至72°C,耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-0H,以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物，按5’一3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。PCR反应混合物的组成：典型的PCR反应体系由如下组分组成：反应缓冲液(Buffer)dNTP(dATP,dCTP,dGTPanddTTP)MgC12两个DNA引物DNA模板耐热Taq聚合酶PCR的特点•灵敏度高•皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平•能从100万个细胞屮检出一个靶细胞•病毒检测

4、的灵敏度可达3个RFU•细菌检测的最小检出率为3个细菌•简便、快速•一次性加好反应液，2〜4小时完成扩增•扩增产物一般用电泳分析•对标本的纯度要求低•血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组等组织的粗提DNA【仪器耗材与试剂】•(一)仪器与耗材1.PCK热循环仪2.琼脂糖凝胶电泳系统3.吸头、离心管•(二)试剂1.10XPCRBuffer2.dNTP(其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP;每种浓度均为2.5mmol/L)3.4.5.M13Forward和Reverse引物(10uM)DNA模板(质粒DNA

5、,100ng/yL)TaqDNA聚合酶(5U/yL)【实验步骤】1.在0.2mLEppendorff管

6、A

7、配置25uL反应体系:反应物体积（UL）ddH2017.2PCR缓冲液（10X）2.5dNTP(10mmol/L)2引物11引物21模板DNA1TaqDNA聚合酶0.32.按下述程序进行PCK扩增：1)94°C预变性3min；2)94°C变性30sec3)55°C退火45sec;4)72°C延伸1min；5)重复步骤2~4,29次;6)72°C延伸10min；7)End.3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制

8、1%琼脂糖凝胶，取10PL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。【思考题】1、影响PCR反应效率的因素有哪些？2、如何有效地提高PCR反应的效率？实验中要注意的问题1、微量移液器的正确使用。景程的选择、吸取和推出液体试剂时的注意事项、吸取液体试剂时简单目测试剂的量、如何有效减少误差、每次吸取试剂后更换吸头。2、试剂的充分混合3、良好的秩序实验二质粒DNA及其酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测一、琼脂糖凝胶电泳试剂：1XTAE电泳缓冲液琼脂糖10X电泳加样缓冲液溴化乙锭（EB）1.制备凝胶制备琼

9、脂糖凝胶（1%）IXTAE50ml琼脂糖0.5g放入50ml的锥形瓶中，加热溶化后再加入溴化乙锭（EB）至总浓度为1g/ml灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却。凝胶在室温下放罝30min，使其自然凝结，小心拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。2.加样•取回收的DNA样品201,•加样缓冲液31（6X）,混匀，点入琼脂糖的样品孔内。•加样DNAmarkerDL200061。•开始电泳（120V）,当溴酚蓝迁移到距凝胶下缘2cm时，停止电泳。•利用紫外投射仪观察DNA条带。实验

10、三大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12法）实验目的掌握CaC12法制备大肠杆菌感受态细胞的原理，学会制备感受态细胞的方法。实验原理•用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株。•受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaC12等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带冇外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。实验仪器、材料与试剂（一）