鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定.pdf

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1、兽医临床鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定石浩(青岛澳兰百特生物工程有限公司山东青岛266100)鸡传染性支气管炎(IB)在临床上可分为呼吸将用抗生素处理过的病料上清液通过尿囊腔接型、肾型、肠型等多种病型。鸡传染性支气管炎病毒种10日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚接种0．2毫升上清液，(IBV)可使不同日龄、品种和性别的鸡感染，IBV感接种3枚鸡胚，标明①、②、③；于电热恒温培养箱中染的症状与感染的毒株、日龄及并发症的存在性等37℃培养36小时，每天照胚2次，检查鸡胚活性，弃因素有关。1—4周龄鸡感染后精神不振、呼吸困难，并去24小时内死亡的鸡胚；连续盲传5代并无菌收集出现死亡，其

2、中幼鸡死亡率约25％，雏鸡死亡率高达尿囊液。75％～90％。肾型IBV感染时，主要表现为咳嗽和甩病毒的RT—PCR检测包括病毒RNA的提取，病鼻，精神沉郁、羽毛松散。大多数病鸡食欲下降，饮欲毒cDNA的获取，基因的RT—PCR扩增，电泳。增强，鸡冠发绀，闭目嗜睡，两翅下垂，排绿色或白色IBV传代鸡胚尿囊液的血凝活性测定用微量孔稀粪，同时可见含尿酸盐的白色粪便，并有时涂满肛板法做病毒血凝活性分析。门附近。开产蛋鸡群除有呼吸道症状，产蛋量和蛋的IBV传代鸡胚尿囊液RT—PCR测定取分离毒接品质也随之下降，治愈后产蛋水平大多不能恢复到种鸡胚后的尿囊液，按常规法进行RT—PCR检

3、测。产蛋以前的水平，出现软壳蛋、畸形蛋等情况，但一毒株半数感染量(EID50)的测定。病毒采用毒般死亡率很低。2012年4月17日，山东某大型养鸡株El~E5鸡胚尿囊液。将病毒作l0倍系列稀释。场送检一批疑似鸡传染性支气管炎病毒的死鸡，采10日龄鸡胚接种，采用尿囊腔接种法，按常规方集相关病料进行RT—PCR检测结果发现IBV阳性，法进行。试验设5组。分别用10104个稀释度病初步诊断为鸡传染性支气管炎现介绍如下。毒液接种10日龄SPF鸡胚，每胚0．1毫升，每组51材料与方法枚，同时设生理盐水对照组(0．1毫升／胚)。1．1材料置37~C培养，观察记录鸡胚死亡数或病变情况，

4、病料为疑似鸡传染性支气管炎的病(死)鸡，来计算各稀释度死亡病变情况收集死胚，剖检鸡胚，观自山东省临沂某大型养鸡场。察病变，称量胚重，记录数据。最后加生理盐水研磨实验用l0日龄SPF鸡胚由山东省农科院家禽胚体(注意防止胚体间交叉污染)，收集胚研磨液，研究所提供，本实验室孵化。1％鸡血红细胞悬液由本做好标记，反复冻融3次。实验室制备。EID50的测定按Reed—Muench法计算。主要试剂为M—MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、2结果与讨论TaqDNA聚合酶蛋白裂解液、dNTP、DNAMarker；无病鸡剖检，发现有气管出血，花斑肾等症状，符水乙醇、氯仿、琼脂糖、异丙醇。合鸡感

5、染传染性支气管炎病毒的临床特征。主要仪器设备包括PCR基因扩增仪，DYY一1118病料RT—PCR检测结果与IBV阳性对照均为阳型稳压稳流电泳仪，高压锅，DYY一11131A型电泳性，且条带位置与阳性对照一致，大小为622bp。槽，三孔电热恒温水槽，电热恒温培养箱，微型漩涡收集28—36小时鸡胚尿囊液，标号①、②、③。混合仪，台式高速冷冻离心机，超净工作台，紫外分IBV分离株的各代鸡胚尿囊液做血凝实验，反应光光度计。呈阴性。引物可参照GenBank发表的IBV全基因核苷酸传代鸡胚尿囊液的RT—PCR的检测结果显示序列中的全基因序列设计的1对特异性引物(B1、IBV阳性，所

6、能够检测的其他病毒均为阴性，诊断该B2)用于传染性支气管炎阳性病料的检测。引物为N病由传染性支气管炎病毒感染所致。基因的1段保守序列。EID50检测结果分析，存活鸡胚病变情况表现为1．2方法现胎儿蜷缩、生长阻滞，皮肤出血点明显等。有的鸡对病鸡进行剖检，察，取病死鸡的肺、气管、野胚大腿及尾部有点状出血，有的呈弥漫性出血；羊膜增厚，紧贴鸡胚，肾小管、输尿管有白色尿酸盐沉着。脏等组织，剪碎，处理。养殖技术顾问2013．2