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《鸡传染性法氏囊病病毒福建株的分离与初步鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、鸡传染性法氏囊病病毒福建株的分离与初步鉴定摘要从临床表现胸腿肌出血、法氏囊肿大出血为主要特征的病死鸡肝脾和法氏囊中分离到1株病毒(IBDV-FJ)o结果表明，该分离病毒无血凝性,在琼脂扩散试验中能与抗IBDV特异性血清出现1条清晰的口色沉淀线;人工感染28口龄雏鸡出现与临床一致的病变，并回收到病毒;应用针对IBDVVP3基因的特异性引物进行RT・PCR,能扩增到长度为1041bp的特异性目的片段;序列分析发现分离毒VP3基因与IBDV超强毒和经典毒株的核甘酸同源性分别为97.7%〜98.2%和95.2%。初步鉴定该分离毒为鸡传染性法氏囊病病
2、毒超强毒株。关键词鸡传染性法氏囊病病毒;超强毒株;分离;鉴定传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是1种危害幼龄鸡的急性、高度接触性免疫抑制性传染病,3〜6周龄雏鸡最易感,7H龄内雏鸡感染可引起严重的免疫抑制，导致感染鸡对其他疫苗的免疫失败。1979年在我国北京郊区发现该病［1］;1980年周蛟等从北京进口的鸡群中分离到IBD-CJ801株［2］,随后全国各地陆续有该病发生和流行的报道;1985年,在美国Delmarve家禽生产地区发现了1上变异株，它能逃脱标准疫苗株母源抗体的保护;1989年,Ch・ett
3、le等在荷兰分离出高致病力的IBDV毒株(veryvirulentinfcctiousbursaldiseasevirus,vvIBDV);近年来国内也报道了vvIBDV的流行［3・6］。2007年福建省某鸡场35日龄2000多羽免疫鸡群突然发病死亡，发病率和死亡率分别达73%和52%,剖检变化主要为胸肌和腿肌条状出血;法氏囊明显肿大为正常法氏囊的2〜4倍，有的外观呈紫葡萄状,切开后可见内侧皱褶而出血，有的可见干酪样物质或炎性分泌物，肾肿胀、尿酸盐沉积，脾脏肿大，表面斑驳。经免疫荧光试验检测，初步诊断为鸡传染性法氏囊病。故无菌采集病鸡法氏囊
4、、肝脾等组织进行病毒分离与鉴定，现将结果报告如下。1材料与方法1.1试验动物和血清9〜10日龄SPF鸡胚购自福建省生药厂;28日龄雏鸡为非免疫健康鸡并经AGP检测母源抗体阴性;抗IBDV阳性血清购自中监所;抗IBDV单抗由福建省农科院畜牧兽医研究所动物病毒研究室提供。1.2受体菌、质粒载体和主要试剂E.coilJM109菌株由福建省农科院畜牧兽医研究所动物病毒研究室提供;T4DNA连接酶、pMD18-T载体、鼠源反转录酶(M・MLV)、RNA酶抑制剂(RNasin)、rTaq聚合酶、Trizol试剂盒购口宝生物工程有限公司(大连);DNA胶
5、回收试剂盒与质粒快速捉取试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。1.3病毒分离1.3.1病料采集与处理。无菌采集具典型病变的病死鸡法氏囊及肝脾，加Hank's制成20%匀浆，冻融3次,4OOOrpm离心15min,取上清液加青霉素、链霉索各1000IU/mL,置4°C冰箱中过夜处理备用。1.3.2鸡胚接种。取上清液，经绒毛尿囊膜接种9〜10H龄SPF鸡胚，每胚0.2mL。收集48〜120h的死胚尿囊液和胚膜混合匀浆，离心取上清液即为分离毒记IBDV-FJo1.4病毒鉴定1.4.1人工感染试验。分离毒经点眼、滴鼻接种28FI龄雏鸡4只，每只0.
6、2mL,同时以健康雏鸡为对照，隔离饲养。观察发病死亡情况,并收集病死鸡法氏囊，用于制备AGP抗原和回收病毒。1.4.2AGP抗原制备。采集人工感染病死鸡法氏囊,用生理盐水作1：4匀浆处理,置冰箱中冻融3次，离心，取上清液即为分离毒AGP抗原。1.4.3琼脂扩散试验。制备厚3mm1%琼脂(含8%NaCl)平板，按常规打孔，屮央孔加标准抗IBDV阳性血清，周围孔加分离毒AGP抗原，置湿盒中37°C过夜，观察结果。1.4.4免疫荧光试验。取临床采集或人工感染病死鸡法氏囊制成6pim厚的冰冻切片，用冷丙酮固定lOmin,加抗IBDV单抗，置湿盒屮3
7、7°C30min,再加FITC标记的羊抗鼠・IgG30min,洗涤后以甘油・PBS封片。荧光显微镜下观察，以出现亮绿色荧光病灶判定为阳性。145分离毒VP3基因RT-PCR鉴定。①引物的设计与合成。根据GenBank上已公布的vvIBDVVP3基因序列，用OLIGO6.0软件设计1对引物：P1:5，・CAGCTTGCATGCCTGCAGG-3Z;P2:5AACCTGATTACGAATTCGAGCTCG-3；两引物位于IBDVVP3基因首末端保守区,扩增产物约为1041bp,由宝生物工程有限公司(大连)合成。②RNA捉取。取250pL病毒液加
8、入750
9、iLTrizolRNA捉取液，混匀，室温放置15mino加入200(xL氯仿，振荡混匀,4°C12000rpm离心15min0取上清加入500gL异内醇，室温放置10m
