抗人Cx31第234位磷酸丝氨酸抗体的制备.pdf

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1、第21卷第3期湖南理工学院学报(自然科学版1Vo1．2lNO．32008年9月JournalofHtmanInstituteofScienceandTechnolow~fNaturalSciencesSeD．2008抗人Cx31第234位磷酸丝氨酸抗体的制备寻晓红，刘宇(湖南理工学院化学化工系，湖南，岳阳，414006)摘要：利用磷酸化多肽合成技术合成Cx31羧基端磷酸多肽片段(csPsssApSRAST)，经HPLC纯化、质谱证实后偶联到匙孔槭血蓝蛋白，免疫新西兰雄兔后采血检测、并经过特异性纯化、经Westernblowing检测，证实得到的抗体为抗间隙连接蛋白31第2

2、34位丝氨酸的特异抗体．关键词：Cx31；磷酸多肽合成；Westernbloting中图分类号：TQ936文献标识码：A文章编号：1672—5298(2008)03—0052—04Preparationofthe234thPhosphserineoftheCx31AntibodyXUNXiao—hong，LIUYu(DepartmentofChemistryandChemicalEngineering，HunanInstituteofScienceandTechnology,Yueyang414006，China)Abstract：Thepeptide．KLHsoluti

3、onwasmixedwithfreund’Scompleteorincompleteadiuvantandimmunizedrabbittopreparespecificpolyclonalantibodyagainstthetopologyofconnexin31．Afull-lengthhumanconnexin31genewasclonedintoexpressionvector,pcDNA3．1／myc—his(一1B，andvansformedintoHT1080celllinestably．Theexpressedproteinwasusedtoensuret

4、hepolyclonalantibody~Westernblottinganalysissuggestedthatthepolyclonalantibodyrecognizethefusionproteinoftheconnexin31-myc．Theantiserumagainstconnexin3lpreparedbydifierentialimmunogenicpeptide．KLHhasgoodspecificity．Keywords：connexin3l：phosph—peptidesynthesis；westernblotting间隙连接(gapiunctio

5、n)是在相邻细胞问形成的一类聚合通道，这类通道允许小分子物质如离子、第二信使以及代谢过程中产生的某些分子通过【l，2】，几乎所有的细胞与组织均利用间隙通道来传递信息．间隙连接通道在细胞增殖，胚胎发育和肿瘤抑制过程中均起着十分重要的作用口】．形成间隙连接的间隙连接蛋~(Connexin)是一多基因家族，该家族不同蛋白之间具有高度相似性：均由4个跨膜结构域，2个胞外环，1个胞内环和位于胞质部分的氨基端与羧基端组成．其中跨膜区与胞外环高度保守，而胞质部分则相对保守性较低【]．间隙连接蛋白3l(Cx31)是问隙连接蛋白家族中的一员，其基因突变可导致常染色体显性听力下降【1、常染色

6、体隐性听力下降]、周围神经疾病伴听力丧失【9]、以及变性红皮肤病角化病⋯，显示该间隙连接蛋白在维持正常的生长发育与生理功能方面具有重要的作用．而问隙连接蛋白磷酸化在其功能的调控中起十分重要的作用，前期的研究显示，Cx31第234位丝氨酸磷酸化，对其功能及其调节进行研究，必须得到它的特异性抗体．本实验设计并合成了间隙连接蛋白3l羧基端CSPSSSApSRAST多肽序列，经纯化后偶联到匙孔槭血蓝蛋白(KLH)上，作为抗原免疫新西兰兔，获得可用于westernblot检测的特异性抗人间隙连接蛋白31第234位磷酸丝氨酸多克隆抗体．1材料与方法1．1仪器与材料Pioneer多肽合

7、成系统(ABI公司)，基质辅助激光解析飞行时间质谱(ABI公司)，高效液相色谱(Waters公司)．新西兰雄兔．所有多肽合成试剂(ABI公司)，匙孔槭血蓝蛋I~l(Sigma公司)，弗氏佐剂(GibicoBRL公收稿日期：2008—05—20基金项目：湖南省教育厅青年基金项目(07B029)作者简介：寻晓~(1972—1，女，湖南浏阳人，湖南理r学院化学化工系实验师．主要研究方向：蛋白质化学第3期寻晓红等：抗人Cx31第234位磷酸丝氨酸抗体的制备53司)，sulfolinkcouplinggel(pierce公司)，ECLP